Питательная среда для культивирования молочнокислых и бифидобактерий

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И БИФИДОБАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новик Галина Ивановна Штайда Анастасия АлександровнаЭстера Швайцер-Дей(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Питательная среда для культивирования молочнокислых или бифидобактерий, содержащая питательную основу, полученную автоклавированием в дистиллированной воде с последующим фильтрованием грубой, задерживающейся на сите 8 меш, или тонкой, проходящей через сито 50 меш, фракций ячменной дробины, взятых в количестве 1-3 от массы воды, лактозу, дрожжевой экстракт и, при необходимости, аскорбиновую кислоту,ацетат аммония, ацетат натрия, три-натрий цитрат, магний сернокислый семиводный и марганец сернокислый при следующем соотношении компонентов, мас.лактоза 0,9-1,0 дрожжевой экстракт 0,4-0,6 аскорбиновая кислота 0-0,05 ацетат аммония 0-0,3 ацетат натрия 0-0,2 три-натрий цитрат 0-0,3 магний сернокислый семиводный 0-0,012 марганец сернокислый 0-0,005 питательная основа остальное,и дополнительно содержащая агар в количестве 2 от массы указанных компонентов или 20 мМ трис-С в количестве, необходимом для доведениядо величины 6,8 или 7,2. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано для культивирования молочнокислых и бифидобактерий с целью производства бактериальных препаратов на их основе. В настоящее время широкое распространение получают технологии изготовления биопрепаратов и пробиотиков, которые содержат живые клетки представителей нормальной микрофлоры человека (молочнокислых и бифидобактерий). Подобные лекарственные, ле 12140 1 2009.08.30 чебно-профилактические средства, диетические продукты питания используются для целей медицины, функционального питания и оздоровления населения. Молочнокислые и бифидобактерии являются еще и продуцентами биологически активных веществ (полисахаридов, ферментов, витаминов, органических кислот и др.). При культивировании рост бифидо- и молочнокислых бактерий в основном ограничен источниками азота и углерода. Кроме того, для нормальной жизнедеятельности этим микроорганизмам требуются дополнительные ростовые факторы (витамины, пуриновые и пиримидиновые азотистые основания), которые должны присутствовать в среде в готовом виде, так как эти бактерии не могут самостоятельно их синтезировать. Именно поэтому все среды, предназначенные для культивирования молочнокислых и бифидобактерий,имеют сложный состав, куда входит большое число разнообразных компонентов. В этой связи представляет интерес разработка новых экономически выгодных способов культивирования и питательных сред для выращивания этих групп бактерий, которые бы удовлетворяли всем потребностям микроорганизмов и позволяли получать высокую концентрацию жизнеспособных клеток в биомассе. Известно множество питательных сред для культивирования бифидо- и молочнокислых бактерий. Это такие среды, как печеночно-цистеиновая среда,6, питательная среда на основе сердечно-мозгового экстракта (ВНВ), среда Блаурокка 3, питательная среда для выращивания лактобактерий 2 и др. Однако эти среды являются дорогостоящими или трудоемкими в приготовлении. Наиболее близким к заявляемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является питательная среда для культивирования бифидобактерий 1,которая в качестве основы содержит Эпидермат-О (гидролизат строжки кожи млекопитающих ферментативный сухой), в качестве углеводной добавки - препарат из кислой соевой мелассы (отход производства соевого белкового изолята), а также дополнительные компоненты. Углеводный компонент среды получают путем электрохимической активации кислой соевой мелассы в катодной зоне до- 420 мВ и 6,8-7,0 с последующей сублимационной сушкой до остаточной влажности около 4 по массе. Питательная среда имеет следующий состав (по массе) питательная основа Эпидермат-О 280,5 препарат из кислой соевой мелассы 15,40,5 хлористый натрий 50,5 дистиллированная вода до 1000. Однако эта питательная среда имеет ряд недостатков она является дорогостоящей, так как содержит дефицитные компоненты (Эпидермат-О) трудоемкий процесс приготовления (препарат из кислой соевой мелассы) выращивание бактерий на этой среде не позволяет получить титр клеток, превышающий 109 КОЕ/мл 1. Задачей изобретения является создание питательной среды для культивирования бифидо- и лактобактерий на основе растительного сырья, дешевой, не содержащей дорогостоящих отходов животного происхождения и позволяющей получать высокий выход биомассы. Технический результат изобретения достигается использованием в качестве питательной основы предлагаемой среды ячменной дробины - отхода процесса пивоварения. Ячменная дробина состоит из двух фракций - белковой и полисахаридной. Белковая фракция дробины происходит из хордеинов и состоит, главным образом, из гидрофобных пептидов и белков. Известно, что представители некоторых видовиспособны секретировать внеклеточные и внутриклеточные протеиназы, что делает возможным их рост на средах, содержащих трудно гидролизуемые белковые соединения. Полисахаридная фракция ячменной дробины, обогащенная белком дрожжевого экстракта,2 12140 1 2009.08.30 также является сбалансированной средой для роста пробиотических микроорганизмов. Фракции дробины являются ценной основой для приготовления питательной среды для роста микроорганизмов, так как содержат большое число разнообразных компонентов 4,5 (табл. 1). Таблица 1 Состав ячменной дробины (в 1 кг) Показатель Сырая Сухая Сухое вещество, г 232 887 Сырой протеин, г 58 217 Сырая клетчатка, г 39 160 Сырой жир, г 17 60 В состав среды, кроме фракций дробины, входят дополнительные компоненты при следующем их соотношении (мас. ) лактоза 0,9-1,0 аскорбиновая кислота 0-0,05 дрожжевой экстракт 0,4-0,6 ацетат аммония 0-0,3 ацетат натрия 0-0,2 три-натрий цитрат 0-0,3 магний сернокислый семиводный 0-0,012 марганец сернокислый 0-0,005. Таким образом, отличием предлагаемой питательной среды является использование в качестве основы отхода пищевой промышленности - ячменной дробины, - что значительно снижает себестоимость среды, а также обеспечивает поддержание непрерывного процесса рециркуляции промышленных ресурсов. Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Рост бактерий на питательной среде на основе ячменной дробины. Предлагаемую питательную среду на основе фракций ячменной дробины готовят следующим образом. На первом этапе осуществляют фракционирование дробины просеиванием через сито. В результате этого происходит разделение дробины на две фракции грубую (задерживается на сите при размере ячеек 8 меш) и тонкую (проходит через отверстия в 50 меш). Затем 20 г одной из фракций ячменной дробины вносят в 1000 мл дистиллированной воды и автоклавируют в течение 30 мин, после чего охлаждают и фильтруют. В полученную таким образом питательную основу вносят дополнительные компоненты(табл. 2). Для получения твердой питательной среды добавляют 2 агара, а жидкой питательной среды - 20 мМ Трис-, доводятдо 7,2 - для бифидобактерий и до 6,8 - для молочнокислых бактерий. Среду разливают в стерильные пробирки высоким столбиком или в колбы, затем повторно стерилизуют при 0,75 атм. в течение 25 мин. Перед посевом среду регенерируют на водяной бане в течение 10 мин, охлаждают до 37 и засевают чистой культурой штамма молочнокислых или бифидобактерий из расчета 5 инокулята от объема питательной среды. Посевы выдерживают при 37 С в течение 24 и 48 часов до интенсивного помутнения питательной среды. Варианты питательной среды Ростовая среда Состав среды тонкая фракция 1,0 экстракт тонкой фракции тонкая фракция-10,9 лактозы, 0,03 аскорбиновой кислоты и 0,4 дрожжевого экстракта тонкая фракция-20,2 ацетата аммония, 0,1 ацетата натрия, 0,2 три-натрий цитрата, 0,0147 Н 2 О и 0,0044 грубая фракция 1,0 экстракт грубой фракции грубая фракция-10,9 лактозы, 0,03 аскорбиновой кислоты и 0,4 дрожжевого экстракта грубая фракция-20,2 ацетата аммония, 0,1 ацетата натрия, 0,2 три-натрий цитрата, 0,0147 Н 2 О и 0,0044 тонкая фракция 3 экстракт тонкой фракции тонкая фракция-11,0 лактозы, 0,05 аскорбиновой кислоты и 0,6 дрожжевого экстракта тонкая фракция-20,3 ацетата аммония, 0,2 ацетата натрия, 0,3 три-натрий цитрата, 0,01247 Н 2 О и 0,0054 грубая фракция 3 экстракт грубой фракции грубая фракция-11,0 лактозы, 0,05 аскорбиновой кислоты и 0,6 дрожжевого экстракта грубая фракция Оценку ростовых свойств среды осуществляют путем посева 24-часовой культуры бактерий (молочнокислых или бифидобактерий) в количестве 5 от объема среды, культивирование посевов проводят при температуре 37 С. Результаты учитывают через 2448 часов по наличию интенсивного роста культуры. Для посева используют следующие штаммы БИМ В-87, БИМ В-91,БИМ В-194. , БИМ В-1009 . , полученные из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси) .-42, предоставленный Всероссийским научно-исследовательским и конструкторским молочным институтом ГО-13 В. , предоставленный Московским НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского культуру молочнокислых бактерий., выделенную из коммерческой субстанции(Иммунопрепарат, Россия). На варианты питательной среды, в которых содержание фракций ячменной дробины и дополнительных компонентов является минимальным (РР-1 - РР-3 -1 - -3), высевают клетки штаммов бактерий ГО-13 .и БИМ В-1009 . . Определение количества микроорганизмов в конце культивирования в 1 мл среды (жизнеспособность клеток) проводят путем посева серийных разведений на тиогликолевую среду. Результаты учитывают через 72 ч культивирования при 37 С. Биомассу определяют путем измерения оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм. В каждом варианте бактериальной культуры проводят измерение(табл. 3). Количество жизнеспособных клеток бактерий, полученных на всех приведенных вариантах питательной среды (табл. 2), составляет 106-1010 в 1 мл. Показатели, характери 4 12140 1 2009.08.30 зующие жизнеспособность и интенсивность жизнедеятельности клеток, выше при выращивании бактерий на вариантах питательной среды с содержанием экстрактов фракций ячменной дробины (2 ) и при наличии дополнительных компонентов в среде культивирования (табл. 3). Титр клеток бактерий при выращивании на этих вариантах среды составляет 109-1010 в 1 мл, в то время как на среде-прототипе титр не превышает 109 в 1 мл 1. Бифидо- и молочнокислые бактерии являются продуцентами молочной и уксусной кислоты - основных метаболитов ферментации гексоз. Поэтому одним из показателей интенсивности протекания метаболических процессов является уровень продукции этими микроорганизмами органических кислот. Содержание ацетата измеряется с использованием метода газовой хроматографии на колонке - при 80-140 С, температуре инжектора 180 С и пламенноионизационного детектора 260 С. Азот применяется как газ-носитель при скорости потока 67 мл/мин. Профильтрованную пробу (0,9 мл) смешивают с 0,1 мл 10 фосфорной кислоты и 1 мкл этой смеси вводят в импульсном режиме. Для характеристики ацидогенеза бифидобактерий концентрация молочной кислоты рассчитывается по Лауэру 7. Результаты измерений приведены в табл. 4. Таблица 3 Рост клеток молочнокислых и бифидобактерий на средах, содержащих фракции пивной ячменной дробины (состав сред приведен в табл. 2) Штамм Ацидогенез клеток молочнокислых и бифидобактерий на средах, содержащих фракции пивной ячменной дробины. Расшифровка сокращений приведена в табл. 1. Для сред,содержащих соли уксусной кислоты (табл. 2), для коррекции значений концентрации ацетата в среде культивирования производили вычитание соответствующих исходных значений. Уровень продукции уксусной кислоты измеряли через 24 ч. 6 12140 1 2009.08.30 Высокий уровень продукции уксусной и молочной кислот бактериями БИМ В-87 В.и. на питательных средах на основе фракций ячменной дробины свидетельствует об интенсивно протекающих процессах метаболизма этих микроорганизмов. Пример 2. Способ поверхностного культивирования бифидо- и молочнокислых бактерий на средах на основе ячменной дробины в анаэробных условиях. В чашки Петри на твердые питательные среды высевают штаммы бактерий. Чашки с культурами помещают на 5 суток в анаэробные условия с относительным содержанием азота, углекислого газа и водорода 811. Через 5 суток производят анализ интенсивности роста микроорганизмов и подсчет выросших колоний (табл. 5). Результаты, приведенные в табл. 5, свидетельствуют о том, что предлагаемые питательные среды могут быть использованы для поверхностного культивирования бифидо- и лактобактерий в анаэробных условиях с целью получения бактериальных клеток без примесей компонентов питательной среды, что может быть с успехом использовано в медицине и пищевой промышленности. Таблица 5 Рост молочнокислых и бифидобактерий при поверхностном культивировании на средах на основе ячменной дробины Штамм бактерий Среда Рост- сплошной рост, - множественные колонии, не подлежащие учету, - единичные мелкие колонии. Таким образом, высокая ростовая активность, накопление биомассы, продукция уксусной и молочной кислот на средах, основанных на ячменной дробине, свидетельствуют о том, что бактерии синтезируют и секретируют различные ферменты, необходимые для утилизации компонентов среды. Совершенствование и удешевление технологии получения пробиотиков может быть обеспечено за счет использования пивной ячменной дробины как субстрата для приготовления питательных сред в промышленных масштабах, что сделает экономически привлекательным процесс накопления биомассы с использованием питательных сред на основе ячменной дробины. Источники информации 1.2227805, МПК 12 1/20, 2002. 2.2216587, МПК 12 1/20, 2001. 3..// . . . ., . - 1939. - . . 144. - .75-79. 7 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8