Способ определения состава и соотношения свободных аминокислот и их метаболитов в биологическиом материале

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА И СООТНОШЕНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный университет имени Янки Купалы(72) Авторы Нефдов Леонид Иванович Глазев Антон Анатольевич Городилов Юрий Николаевич Бабарика Николай Николаевич(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный университет имени Янки Купалы(57) Способ определения свободных кислот и их метаболитов в биологическом материале методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, заключающийся в том, что отобранную пробу биоматериала подготавливают к анализу с применением раствора хлорной кислоты, содержащей -аминовалериановую кислоту в качестве внутреннего стандарта, перемешивают, центрифугируют при 12000 об/мин при температуре 4 С и фильтруют, полученный фильтрат обрабатывают 0,3 -ным ортофталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в 0,4 натрий-боратном буфере с 9,4, а затем раствором -хлорида в ацетонитриле в концентрации 5 мг/мл, проводят определение аминокислот на хроматографической колонке 8 2,1150 мм с размером частиц 3,5 мкм с градиентным элюированием с использованием состава, содержащего 0,1 натрий-ацетатного буфера с 5,8 и ацетонитрила, взятых в соотношении 3070, в качестве подвижной фазы при скорости подачи потока элюента 0,2 мл/мин, температуре хроматографической колонки 38 С и детектированием по флуоресценции при длине волны возбуждения 231 нм и длинах волн эмиссии 313 и 445 нм. 18078 1 2014.04.30 Изобретение относится к области аналитической и клинической биохимии, в частности к анализу свободных аминокислот и их метаболитов в биологическом материале, и может быть использовано для диагностики метаболических нарушений организма человека и животных, а также для контроля качества и безопасности кормового сырья и продуктов питания. Известен способ определения состава и соотношения свободных аминокислот и их метаболитов в биологических жидкостях, основанный на разделении методом ионообменной (катионообменной) хроматографии на аминокислотных анализаторах 1. При применении известного способа определения состава и соотношения свободных аминокислот и их метаболитов в биологических жидкостях методом ионообменной хроматографии элюирование аминокислот и их метаболитов производят ступенчатым градиентом -цитратных буферных растворов, с последующим нанесением исследуемой смеси на аналитическую колонку размером 3,5220 мм, заполненную сферическим катионообменником 2 В (размер частиц 8 мкм) (, ЧСФР), и дальнейшим последовательным осуществлением хроматографического разделения исследуемых соединений-цитратными буферами. Скорость потока растворов при этом 14 мл/ч, рабочее давление на колонке 2,5-3,5 МПа, температура анализа дискретно повышается в середине аналитического цикла от 40 до 62 С. Количественное содержание каждого компонента, из спектра исследуемых соединений, оценивается после постколоночной дериватизации 1 раствором нингидрина в капиллярной бане при 100 С при длине волны 520 нм после прохождения через проточную кювету однолучевого фотометра. Весь цикл аналитического процесса составляет 200 мин. Способ позволяет определить 22 аминокислоты из биологических жидкостей. К недостаткам известного способа следует отнести невозможность определения полного спектра свободных аминокислот и их метаболитов в различных по составу и свойствам образцах биологического материала в широком диапазоне их количественных значений, вследствие ограниченности возможностей разделения соединений при данных хроматографических условиях. Кроме того, к недостаткам известного способа следует отнести трудоемкость и длительность анализа, а также необходимость приобретения дорогостоящего измерительного оборудования и сложность его эксплуатации. Задачей изобретения является создание способа, позволяющего расширить определяемый спектр свободных кислот и их метаболитов в различном по составу и свойствам биологическом материале растительного и животного происхождения, увеличить чувствительность определения количественных и качественных характеристик кислот в биологических материалах, сократить время аналитического цикла, а также сократить количество используемых химических реактивов. Технический результат достигается тем, что в заявленном способе определение свободных кислот и их метаболитов в биологическом материале производят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом отобранную пробу биоматериала подготавливают к анализу с применением раствора хлорной кислоты, содержащей-аминовалериановую кислоту в качестве внутреннего станлдарта, перемешивают, центрифугируют при 12000 об/мин при температуре 4 С и фильтруют, полученный фильтарат обрабатывают 0,3 -ным ортофалиевым дльдегидом и 3-меркаптопропионовойц кислотой в 0,4 М натрий-боратном буфере с 9,4, а затем -хлорида в ацетонитриле в концентрации 5 мг/мл, проводят определение аминокислот на хроматографической колонке 8 2,1150 мм с размером частиц 3,5 мкм с градиентным элюированием с использованием состава, содержащего 0,1 натрий-ацетатного буфера с 5,8 и ацетонитрила, взятых в соотношении 3070, в качестве подвижной фазы при скорости подачи потока элюента 0,2 мл/мин, температуре хроматографической колонки 38 С и детектированием по флуорисценции при длине волны возбуждения 231 нм и длинах волн эмиссии 313 и 445 нм. 2 18078 1 2014.04.30 Способ определения свободных кислот и их метаболитов в биологическом материале осуществляется следующим образом. Для осуществления способа используют пробы биоматериала в виде хлорнокислых экстрактов образцов. Подготовка проб биологических жидкостей и растительных экстрактов или гомогенизация образцов первичного материала осуществляется с применением раствора хлорной кислоты, содержащей внутренний стандарт (-аминовалериановая кислота). Подготовленные пробы тщательно перемешивают и центрифугируют при 12000 об/мин при температуре 4 С. Полученную надосадочную жидкость (хлорнокислый экстракт) отбирают, фильтруют и полученный фильтрат используют для анализа. Для получения ортофталевых и флуоренилметилхлороформатных производных анализируемых аминокислот подготовленный образец хлорнокислого экстракта подвергают предколоночной дериватизации 0,3 ортофталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в 0,4 натрий-боратном буфере,9,4, а затем раствором флуоренилметилхлороформата (-хлорида) в ацетонитриле в концентрации 5 мг/мл. Полученные производные аминокислот определяют методом жидкостной хроматографии на аналитической колонке с обращенно-фазным сорбентом 8 (с размером частиц 3,5 мкм), размер колонки 2,1150 мм, с градиентным элюированием подвижной фазой состава 0,1 натрий-ацетатный буфер 5,83 70 , при скорости потока элюента 0,2 мл/мин, температуре колонки 38 С и детектированием по флуоресценции(при длине волны возбуждения - 231 нм и длинах волн эмиссии - 313 и 445 нм). Определение содержания свободных аминокислот и их метаболитов в анализируемом образце производится путем обработки первичных данных сигнала детектора по методу внутреннего стандарта. Возможность достижения поставленной задачи, заявляемого технического решения,подтверждена экспериментально. Показатели точности способа соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1-4. Таблица 1 Показатель Показатель Предел Предел внутривнутрилаборповторяемо- повторялаборной восной воспроизсти емости производимости водимости Аспарагиновая кислота Глутаминовая кислота Аспарагин Серин аминоадипиновая кислота Аминокислота Глутамин Гистидин Глицин Треонин Цитруллин Аргинин Аланин Таурин Тирозин Валин Метионин Триптофан Изолейцин Фенилаланин Лейцин Гидроксипролин Орнитин Лизин Пролин Продолжение таблицы 1 Показатель Показатель Предел Предел внутривнутрилаборповторяемо- повторялаборной восной воспроизсти емости производимости водимости Таблица 2 Показатель Предел внутПредел поПоказатель внутрилаборной рилаборной Диапазон вторяемовоспроизводи- воспроизвоконцентр повторяемости сти Аминокислота мости димости аций,3 мкмоль/дм, мкмоль/дм 3 3 , мкмоль/дм мкмоль/дм Цистеиновая 10-100 0,5 1,5 0,9 2,5 кислота Аспарагиновая 10-100 0,6 1,7 0,8 2,3 кислота Глутаминовая 10-100 0,6 1,6 0,9 2,4 кислота Аспарагин 10-100 0,9 2,6 1,3 3,6 Серин 10-100 0,4 1,1 0,7 2,0 4-50 0,5 1,4 0,7 2,0 аминоадипиновая кислота Глутамин 10-100 1,1 3,0 1,6 4,4 Гистидин 10-100 0,8 2,1 1,1 3,2 Глицин 10-100 0,4 1,1 0,7 2,0 Треонин 10-100 0,4 1,2 0,7 2,0 4 18078 1 2014.04.30 Продолжение таблицы 2 Показатель Предел внутПредел поПоказатель внутрилаборной рилаборной Диапазон вторяемовоспроизводи- воспроизвоконцентр повторяемости сти Аминокислота мости димости аций,3 мкмоль/дм Диапазон концентАминокислота раций,мкмоль/дм 3 Цистеиновая кислота Аспарагиновая кислота Глутаминовая кислота Аспарагин Серин Глутамин Гистидин Глицин Треонин Цитруллин Аргинин Аланин Таурин Тирозин Валин 18078 1 2014.04.30 Диапазон концентАминокислота раций,мкмоль/дм 3 Метионин Триптофан Изолейцин Фенилаланин Лейцин Гидроксипролин Орнитин Лизин Пролин Продолжение таблицы 3 Предел внутПоказатель внутрилаборной рилаборной восвоспроизвопроизводимости димости Таблица 4 Показатель Показатель Предел внутриПредел по- внутрилаборДиапазон повторяемолаборной восвторяемости ной воспроизконцентрасти производимости Аминокислота водимости ций,мкмоль/дм 3 мкмоль/дм 3 3 3 мкмоль/дм мкмоль/дм мкмоль/дм 3 Глутаминовая 1000-3000 6,0 16,7 6,9 19,3 кислота Глутамин 1000-4500 4,8 13,5 6,1 17,0 Глицин 1000-4000 5,1 14,3 6,7 18,8 Аланин 1000-5000 4,7 13,1 7,3 20,5 Таурин 1000-6000 4,5 12,6 5,8 16,2 Таким образом, предложенным способом возможно определение 35 свободных аминокислот. Сокращается время на проведение аналитического цикла (не превышает 105 минут) уменьшаются материальные затраты на проведение хроматографического процесса. Источники информации 1. Глазев А.А., Методы жидкостной хроматографии аминокислот и их производных. Тез. докл.респ. науч. конф. - Гродно, 26-27 мая, 2004. - Гродно Изд-во ГрГУ, 2004. С. 14-15. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6