Способ количественного определения индоламина в биологическом материале

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДОЛАМИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Семак Игорь Викторович Кульчицкий Владимир Адамович Корик Елена Олеговна Наумова Мария Викторовна Терехович Виктория Анатольевна Чичкан Дмитрий Николаевич Кульчицкий Станислав Владимирович Улащик Владимир Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ количественного определения индоламина в биологическом материале, отличающийся тем, что проводят экстракцию индоламина из биологического материала метиленхлоридом, а затем обратнофазную жидкостную хроматографию полученного экстракта в изократическом режиме с помощью мобильной фазы, представляющей собой 25 -ный водный раствор ацетонитрила, содержащий 0,1 уксусной кислоты, при скорости элюции 10631 1 2008.06.30 0,3 мл/мин и 40 С, при этом регистрируют спектр поглощения элюата в диапазоне длин волн 220-400 нм и одновременно проводят масс-спектрофотометрическую детекцию ионов, имеющих соотношение массазаряд от 160 до 270 при положительной ионизации элюата с помощью электроспрей-интерфейса, индоламин идентифицируют по коэлюции с аутентичным стандартом или по параметрам оотношение массазаряд, спектр поглощения и время удерживания, а его количественное содержание рассчитывают по площади хроматографического пика на масс-хроматограмме. Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторной диагностики. Известен способ определения содержания индоламинов в биологическом материале с помощью газовой хроматографии, когда проводят испарение биологического материала и проводят хроматографию полученных газов и акцентируют внимание на определении только одного вещества, а для определения содержания компонентов комплекса веществ повторяют весь цикл заново 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение индоламинов хроматографическим способом. Однако способ-прототип обладает следующими недостатками при использовании газовой хроматографии термолабильные соединения разрушаются, невозможен анализ водных растворов, невозможно определение активности ферментов и кинетики процессов с участием индоламинов, необходима предварительная химическая модификация анализируемых индоламинов. Задачей заявляемого способа является повышение точности определения индоламинов при различных состояниях исследуемого материала. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ количественного определения индоламина в биологическом материале, когда проводят экстракцию индоламина из биологического материала метиленхлоридом, а затем обратнофазную жидкостную хроматографию полученного экстракта в изократическом режиме с помощью мобильной фазы, представляющей собой 25 -ный водный раствор ацетонитрила, содержащий 0,1 уксусной кислоты, при скорости элюции 0,3 мл/мин и 40 С, при этом регистрируют спектр поглощения элюата в диапазоне длин волн 220-400 нм и одновременно проводят масс-спектрофотометрическую детекцию ионов, имеющих соотношение массазаряд от 160 до 270 при положительной ионизации элюата с помощью электроспрей-интерфейса, индоламин идентифицируют по коэлюции с аутентичным стандартом или по параметрам массазаряд, спектр поглощения и время удерживания, а его количественное содержание рассчитывают по площади хроматографического пика на масс-хроматограмме. В отличие от методов, основанных на обратнофазной хроматографии индоламинов и их последующей спектрофотометрической, флуориметрической, электрохимической или радиометрической детекции, заявляемый способ не требует тщательного хроматографического разделения индоламинов и использования радиоактивных материалов. Способ обеспечивает точную идентификацию индоламинов, находящихся в образце. Идентификацию осуществляют на основании времени удерживания индоламинов, их спектров поглощения и точной массы, определенной с помощью масс-спектрометрического детектора. Пример требуется определить содержание индоламинов в эпифизе, стволе мозга и митохондрии печени крыс. Для этого берут кусочек ткани (1-10 мг) или суспензия митохондрий гомогенизируют на холоду в 100 мкл 0.1 М охлажденной перхлорной кислоты в течение 1 мин. Гомогенат центрифугируют при 4 С в течение 20 мин при 10000. К надосадку добавляют метиленхлорид в соотношении 15 (объем/объем). Смесь интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Для быстрого разделения на водную и органические фазы смесь центрифугируют при 4 С в течение 5 мин при 1000. Отбирают нижнюю фракцию(метиленхлорид). К водной фракции снова добавляют метиленхлорид в соотношении 2 10631 1 2008.06.30 15 (объем/объем) и проводят повторную экстракцию. Метиленхлоридные фракции объединяют и упаривают (в токе азота или на вакуумном центрифужном концентраторе). Осадок растворяют в 40-100 мкл метанола. После чего 20 мкл образца наносят на обратнофазную колонку. Элюцию осуществляют в изократическом режиме с помощью мобильной фазы,состоящей из 25 водного раствора ацетонитрила и 0.1 уксусной кислоты при скорости элюции 0.3 мл/мин при 40 С. В потоке снимают спектры поглощения элюата в диапазоне длин волн 220-400 нм и проводят масс-спектрометрическую детекцию ионов с соотношением масса/заряд в диапазоне 160-270 при положительной ионизации элюата с помощью электроспрей-интерфейса. В случае анализа продуктов ферментативной реакции с участием индоламинов аликвоту реакционной смеси (забуференного водного раствора) наносят на обратнофазную колонку без предварительной пробоподготовки. Хроматографическое разделение, спектрофотометрический и масс-спектрометрический анализы образца проводят по описанной выше схеме. Индоламины и их метаболиты идентифицируют по соотношению масса/заряд, спектрам поглощения, а также по коэлюции с аутентичными стандартами. Содержание в образце конкретного индоламина или его метаболита рассчитывают с помощью калибровочного графика по площади хроматографического пика на масс-хроматограмме иона с соответствующим соотношением масса/заряд. Калибровочная кривая сохраняет линейность в диапазоне от 2 до 100 пмолей (фигура), где показана обратнофазная хроматография-массспектрометрия продуктов ферментативной реакции, образовавшихся при инкубации экстракта кожи (А, С, Е) с серотонином и ацетилкоэнзимом А (Б) с серотонином в отсутствие ацетилкоэнзима А (Д, Ж) с серотонином, ацетилкоэнзимом А в присутствии паргилина. Масс-спектрометрическая детекция осуществлялась в режиме мониторинга отдельных ионов (МН)(А, Б) -ацетилсеротонина (масса/заряд - 219) (С, Д) 5-гидроксииндол уксусной кислоты (масса/заряд 192) и (Е, Ж) 5-гидрокситриптофола (масса/заряд 178) 1 -ацетилсеротонин 2-5-гидроксииндол уксусная кислота 3-5-гидрокситриптофол. Одновременная спектрофотометрическая и масс-спектрометрическая регистрация позволяет в ряде случаев отказаться от использования дорогостоящих стандартов индоламинов,не всегда коммерчески доступных. Важным преимуществом является также возможность создания электронной библиотеки масс-спектров индоламинов, обеспечивающей их идентификацию в составе сложных многокомпонентных систем. Разработанный способ обеспечивает одновременное определение в биологических образцах серотонина, -ацетилсеротонина, 5-гидроксииндолуксусной кислоты и 5-гидрокситриптофола, а также мелатонина, его метаболитов (гидроксилированных производных, АФМК и АМК), вследствие чего может быть успешно использован для диагностических целей для анализа метаболизма биогенных индоламинов в неклассических местах их биосинтеза и деградации, а также для определения активности ферментов, участвующих в метаболизме индоламинов. Полученные результаты от использования данного способа найдут применение в клинико-диагностической практике, фармакологии, спортивной медицине и спорте, фундаментальных исследованиях и учебном процессе. Кроме этого, использование данного метода позволит отказаться от использования дорогостоящих стандартов индоламинов, не всегда коммерчески доступных. Источники информации 1.,,// .. 1981. - . 8. - о 7. . 301-304. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3