Способ определения липидного спектра в биологическом материале

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДНОГО СПЕКТРА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Данильчик Валентин Степанович Шишко Георгий Александрович Шарихина Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Способ определения липидного спектра в биологическом материале методом тонкослойной хроматографии, включающий экстракцию липидов, нанесение липидного экстракта на пластины с силикагелем, разделение его на фракции в смеси растворителей, идентификацию липидных фракций и их количественное определение, отличающийся тем, что разделение липидного экстракта осуществляют в три этапа, причем на первом этапе используют смесь хлороформа, метанола и воды в соотношении 54,020,01,5, на втором - смесь петролейного эфира, диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 90,020,01,0 и на третьем - смесь петролейного эфира, диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 90,060,01,0, а количественное определение липидных фракций осуществляют путем сканирования пластин в отраженном свете на денситометре, по полученным результатам определяют процентное содержание каждой фракции, принимая за 100 сумму площадей пиков всех фракций, рассчитанных по формуле( 10 )0 , Фиг. 1 5658 1 где 1 - расстояние от нулевой линии до вершины пика,0 - расстояние от нулевой линии до основания пика, - половина основания пика,0 - поправочный коэффициент, рассчитанный параллельным определением содержания липидных фракций окрашиванием сульфофосфованилиновой и фосфомолибденовой кислотами,затем унифицированным методом определяют суммарные липиды и рассчитывают количество каждой фракции, учитывая ее процентное содержание.(56) Диагностика патологических состояний у новорожденных по данным дифференцированного исследования липидов пуповинной крови. - Мн., 1990. - С. 9-13.2062468 1, 1996.2034849 1, 1995.0652437 1, 1995.0159564 1, 1985.0159563 1, 1985.2042952 1, 1995. Изобретение относится к медицине и биологии и может использоваться для диагностики и прогнозирования патологических состояний у людей и экспериментальных животных. Задачей способа является идентификация и количественная оценка максимально большого количества липидных фракций. Способ осуществляется следующим образом. Берут в зависимости от вида от 30 до 60 мкл биологического материала. Необходимое количество материала вносят в химическую пробирку, в которую медленно вливают 3 мл смеси Фолча (хлороформметанол в соотношении 21). Образуется взвесь мелких частиц денатурированного белка белого цвета (в случае плазмы) или бурых тяжей (в случае эритроцитов). Оставляют пробирку на 15 мин при комнатной температуре, после чего доливают 1,5 мл дистиллированной воды и инкубируют в течение 10-12 ч в холодильнике. В верхней части (водно-метаноловой) содержатся нелипидные компоненты, в нижней (хлороформной) - липидный экстракт. Нижний слой отсасывают и с помощью пипетки переносят в центрифужную пробирку. Объем экстракта доводят до 3 мл добавлением хлороформа, перемешивают, отбирают 0,5 мл для определения уровня общих липидов. Далее липидный экстракт наносят на пластины с силикагелем. Предварительно пластины размечают в положении, в котором продольные полосы (царапины) на обратной стороне перпендикулярны разделительному пути на слое силикагеля. Вдоль пластины наносят продольные линии через 2,0-2,5 см - границы между дорожками (пластину 1515 см можно разделить на 6 дорожек). Высота пластины для тонкослойной хроматографии равна 15,0 см. На пластине вдоль боковых краев счищают слой силикагеля в 2-3 мм с целью уменьшения краевого эффекта. Затем простым мягким карандашом ставят вспомогательные метки. Линию старта на всех пластинах отмечают одинаково. От основания пластины отступают 1,5 см и на этом уровне ставят две точки карандашом, расстояние между которыми должно составлять 0,9-1,0 см - это места нанесения образца. Пластины ставят для промывки в камеру, которую обкладывают полоской фильтровальной бумаги. Заполняют пластину смесью хлороформметанолвода в соотношении 2,71,00,75 соответственно (54,020,01,5) и оставляют для насыщения парами рас 2 5658 1 творителя на 40 мин. После промывки пластину ставят в сушильный шкаф и сушат при 100 С в течение часа для активации. На подготовленную пластину сразу же наносят липидный экстракт в виде узкой полоски (не шире 1 мм) в места линии старта, предварительно закрыв остальной слой силикагеля фольгой. Перед нанесением сухой экстракт липидов растворяют в 40 мкл смеси хлороформметанол (31). Затем пластину помещают в камеру, в которую заливают разделительную смесь хлороформметанолвода в соотношении 2,71,00,75 соответственно, закрывают крышкой и оставляют в вытяжном шкафу при комнатной температуре на две минуты. После этого пластину помещают во вторую камеру, внутри обложенную фильтровальной бумагой и содержащую разделительную смесь (петролейный эфирдиэтиловый эфирледяная уксусная кислота в соотношении 90,020,01,0 соответственно), закрывают крышкой,оставляют на 10 мин. Высушенную пластину помещают в третью камеру, обложенную внутри фильтровальной бумагой и содержащую смесь-растворитель петролейный эфирдиэтиловый эфирледяная уксусная кислота в соотношении 90,060,01,0 на 20 мин. Для выявления фракций пластины обрызгивают свежеприготовленным 5 -ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в 96,6 -ном этиловом спирте. Затем пластины подсушивают на воздухе до испарения растворителя, помещают в сухожаровой шкаф(100 С) на пять минут до появления окрашенных фракций липидов. Липидные компоненты окрашиваются в сине-зеленый цвет на желтом фоне. Пластины прокладывают тонкой бумагой, помещают в полиэтиленовый пакет, хранят в защищенном от света месте для денситометрии. В порядке возрастанияотносительная подвижность фракций (отношение расстояния от линии старта до середины фракции к расстоянию от старта до финиша фронта растворителя) липидные фракции располагаются в порядке, указанном на приведенных денситограммах. Денситометрирование осуществляют на денситометре, сканирующем в отраженном свете на пластине длиной 15 см. По денситограммам определяют процентное соотношение каждой фракции, принимая за 100 сумму площадей пиков всех фракций липидов на денситограмме. Площади пиков соответствующих фракций липидов на хромотограмме рассчитаны по формуле А(1 - Н 0)К 0,где 1 - расстояние от нулевой линии до вершины пика Н 0 - расстояние от нулевой линии до основания пика (фон)- половина основания пика (мм) (1 и Н 0 измеряют в единицах оптической плотности) К 0 - поправочный коэффициент, рассчитанный параллельным определением содержания липидных фракций окрашиванием сульфофосфованилиновой и фосфомолибденовой кислотами. Пример расчета содержания липидных фракций приведен в прилагаемой таблице. Для перехода к количественному определению фракций липидов в г/л определяют общие липиды унифицированным методом с использованием сульфофосфованилинового реактива и делают расчет для каждой фракции, зная ее процентное содержание. Пример осуществления способа проиллюстрирован чертежами, где представлены денситограммы липидных спекторов на тонком слое силикагеля на пластинахфиг. 1- плазмы крови, фиг. 2 - эритроцитарных мембран, фиг. 3 а - отечной жидкости, фиг. 3 б мочи, где 1 - фракция холинсодержащих липидов (ХФ),2 - фракция аминсодержащих фосфолипидов (АФ),3 - фракция преаминсодержащих фософолипидов (пАФ),4 - фракция гликолипидов (ГЛ),5 - фракция моно- и диацилглицеринов (МДГ),6 - фракция 7-холестанол (7 - ХС),3 5658 1 7 - фракция свободный холестерин (СХС),8 - фракция 4-метил-7-холестанол(4-м-7-ХС),9 - фракция 4-метил-8-холестанол(4-м-8-ХС),10 - фракция неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК),11 а - фракция триацилглицеринов 1 (ТГ 1),11 б - фракция триглицеринов 2 (ТГ 2),12 - фракция эфиров холестерина (ЭХС),13 - фракция свободных углеродов (СУ). Описанным способом можно в одной микропробе биоматериала выделить и дать количественную оценку основных классов липидов. Исходные данные для расчета содержания липидных фракций Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5