Способ прижизненного определения биогенных аминов, их предшественников и метаболитов в головном мозге животного

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ, ИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ И МЕТАБОЛИТОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ЖИВОТНОГО(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Зиматкин Сергей Михайлович Денисенко Александр Валентинович Дорошенко Евгений Михайлович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(57) Способ прижизненного определения биогенных аминов, их предшественников и метаболитов в головном мозге животного, заключающийся в том, что животное помещают в стереотаксический аппарат, под общим наркозом через отверстие в черепной коробке вводят в мозг две иглы, затем через первую, которая введена в боковой желудочек мозга, с постоянной скоростью вводят перфузионный раствор, а через вторую, которая введена в большую цистерну мозга, отбирают в течение необходимого времени пробу перфузата,после чего определяют в ней биогенные амины, их предшественники и метаболиты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. Изобретение относится к области биохимии, а именно к аналитической биохимии, и может использоваться для оценки содержания и обмена биогенных аминов в головном мозге лабораторных животных. Наиболее близким к заявляемому является способ определения биогенных аминов в гомогенатах головного мозга крыс,,,,.3,4-, 5-, , 4-3-, , 3,4- ,, ,5-// . , 198238(5)1241-54. Сущность способа заключается в определении уровня биогенных аминов,их предшественников и метаболитов в исследуемых образцах, получаемых путем гомогенизации образцов мозга в перхлорной кислоте и центрифугирования перед инъекцией в колонку. 11346 1 2008.12.30 Недостатками этого метода являются 1) только посмертное определение биогенных аминов в мозгу ( ) 2) невозможность многократного исследования биогенных аминов у одного животного (в динамике). Задача изобретения - обеспечить возможность определения динамики обмена биогенных аминов в головном мозге животных. Поставленная задача решается путем определения биогенных аминов, их предшественников и метаболитов в исследуемых образцах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. При этом отличительным моментом является то, что образцы получают прижизненно из большой цистерны мозга наркотизированного животного после стереотаксического введения ему с постоянной скоростью перфузионного раствора в боковой желудочек мозга. Способ осуществляют следующим образом. Под общим наркозом животных (лабораторные крысы) помещают в стереотаксический аппарат, делают надрез мягких тканей головы,с помощью портативной бормашины просверливают черепную коробку, следуя координатам стереотаксического атласа мозга крысы. Через отверстие в боковой желудочек мозга вводят иглу, соединенную с фторопластовой трубкой, через которую с помощью шприца и микронасоса с постоянной скоростью вводят 0,9 раствор . Вторую иглу вводят в большую цистерну мозга, а соединенную с ней фторопластовую трубку помещают в эппендорфовскую пробирку для сбора проб перфузата. Каждую пробу собирают в течение 5 или 10 мин. Длительность исследования 60-90 мин или более, при необходимости. Точное количество перфузата в каждой пробе высчитывают по разнице в весе пробирки до и после взятия пробы. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией определяют содержание биогенных аминов, их предшественников и метаболитов, а именно- 3,4-дигидроксифенилаланина, - 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, Т - триптофана, Ту - тирозина,норадреналина,- гомованилиновой кислоты, 5- - 5-гидроксииндолуксусной кислоты, 3-МТ - 3-метокситиронина, 5-НТ - 5-гидрокситриптамина (серотонина), 5-НТр 5-гидрокситриптофана,- 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля. Полученные показатели позволяют объективно судить о содержании и метаболизме биогенных аминов в головном мозге. Для иллюстрации полученных результатов приводим данные по содержанию биогенных аминов, их предшественников и метаболитов в перфузате в динамике в течение 60 мин при скорости перфузии 12 микролитров/мин. Содержание биогенных аминов во внутрижелудочковом перфузате при прижизненной вентрикуло-цистернальной перфузии мозга крысы (нМ/л) Время Из таблицы видно, что оттекающий из мозга крысы перфузат содержит биогенные амины, их предшественники и метаболиты, что свидетельствует об их постоянном выделении в межклеточную жидкость мозга. 11346 1 2008.12.30 Таким образом, предлагаемый способ действительно позволяет исследовать прижизненное содержание биогенных аминов, их предшественников и метаболитов в мозгу не нанося значительных повреждений головному мозгу и исключая таким образом привнесение сторонних факторов, могущих оказать существенное влияние на исследование метаболизма. Многократное в течение длительного времени взятие проб перфузата позволяет изучать процесс выделения и метаболизма биогенных аминов в мозгу в динамике. Это позволяет более полно и объективно судить об изменениях содержания биогенных аминов,их предшественников и метаболитов в головном мозге и изучать динамику этого процесса, как единственного фактора воздействия, так и в комплексе с другими метаболически активными соединениями. Способ достаточно надежен и хорошо воспроизводим. Он может быть использован в любой биохимической лаборатории, оснащенной ВЭЖХ с электрохимическим детектором, стереотаксическим аппаратом и микронасосом. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3