Способ определения содержания крахмала в клубнях или зерне поляриметрическим методом

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КРАХМАЛА В КЛУБНЯХ ИЛИ ЗЕРНЕ ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ(71) Заявитель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(72) Авторы Шишлов Михаил Петрович Шишлова Наталья Петровна Шишлова Алла Михайловна Семенова Татьяна Васильевна Шишлов Юрий Михайлович(73) Патентообладатель Республиканское унитарное предприятие Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию(56) Методы биохимического исследования растений. - Л. Колос, 1972. - С. 157-162. РИХТЕР М. и др. Избранные методы исследования крахмала. - М. Пищевая промышленность, 1975. - С. 59-73. БЕЗЛЮДНЫЙ В.Н. и др. Производство растениеводческой продукции резервы снижения затрат и повышения качества. Материалы Международной научно-практической конференции. Жодино, 2008. - Т. 2. - С. 108-110.6673 , 2005.2013043 1, 1994.(57) Способ определения содержания крахмала в клубнях или зерне поляриметрическим методом, при котором микронавеску клубней или предварительно измельченных зерен подвергают гомогенизации в пенициллиновых флаконах в растворе 2 -ной серной кислоты 15229 1 2011.12.30 с использованием специализированного микрогомогенизатора, принципиальная схема устройства которого приведена на фигуре 2, пенициллиновые флаконы герметически укупоривают, помещают в блок-контейнер, который погружают в кипящую водяную баню,проводят гидролиз крахмала в течение 15 минут, гидролизат охлаждают, фильтруют, помещают фильтрат в открытую призматическую микрокювету, измеряют угол вращения плоскости поляризации и определяют содержание крахмала в образце по предварительно полученному калибровочному графику. Изобретение относится к биохимии сельскохозяйственных растений и может быть использовано для определения крахмала в клубнях или зерне индивидуальных растений гибридно-мутантных популяций 2-2, а также в продуктах их переработки на предприятиях агропромышленного комплекса и в лабораториях научно-исследовательских учреждений. Известны способы определения крахмала химическими и поляриметрическими методами (Л). В качестве прототипа может быть принят поляриметрический метод определения крахмала по Эверсу 1. К навеске муки (3-5 г), полученной при размоле средней пробы семян исследуемого образца, приливается 25 мл 1 растворадля гидролиза содержащегося в ней крахмала. Колба с раствором помещается в кипящую водяную баню на 15 мин. По окончании кипячения содержимое колбы охлаждают и для осветления раствора осаждают белковые вещества, добавляя 4 и 46 либо 24, или 7(27)6. Содержимое колбы тщательно перемешивают, доводят до метки и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат наливают в цилиндрическую поляриметрическую кювету с закручивающимися крышками и определяют угол вращения раствора на поляриметре или сахариметре СУ-2. Содержание крахмала (в процентах) вычисляют по формуле, где используются следующие величины угол вращения плоскости поляризации и переводной коэффициент, включающий длину трубки, объем экстракта и массу навески. Международный стандарт Метод определения крахмала (ГОСТ 10845-98) базируется на вышеизложенной методике при наличии незначительных изменений масса навески составляет 5 г муки и объем раствора соляной кислоты - 50 мл 2. К недостаткам прототипа относятся большие навески растительного материала и объемы реактивов для гидролиза крахмала и необходимость осветления гидролизатов. Кроме того, для определения угла вращения поляризованного луча анализируемым раствором используют трубчатые кюветы с завинчивающимися крышками. Недостатком этих кювет является их большой объем, что требует достаточно большого количества раствора для анализа. Например, минимальный объем дециметровой кюветы составляет 10 мл. Раствор необходимо наливать в кювету с избытком для образования мениска, который необходимо срезать покровным стеклом, и затем завинтить крышку, чтобы плотно прижать стекло. Это неизбежно приводит к проливанию раствора и прямому контакту с руками исполнителя, нежелательному в силу того, что в нем присутствуют кислота и ядовитые осадители белковых веществ. Все это создает определенные неудобства при работе, снижает производительность и ухудшает условия труда и, кроме того, что очень важно, не позволяет анализировать малые объемы раствора, а значит, и количества материала. Это создает непреодолимые препятствия для анализа крахмала в зерне индивидуальных растений зерновых культур. Например, количество зерен в колосе гибридных или мутантных растений 2-2 ячменя равно 20-60 шт., что составляет всего 1-3 г. Из этого количества зерен как минимум половину надо оставить на посев, а половину смолоть для проведения анализа. Учитывая, что стандартная методика позволяет определять крахмал в навеске муки не менее 3 г, то в этом случае все зерно будет использовано на анализ. 15229 1 2011.12.30 С помощью предлагаемого нами способа можно проводить анализ крахмала в навесках муки 200-500 мг, что потребует размола всего 10-15 зерен из колосьев индивидуальных растений. Решаемой задачей изобретения является разработка высокопроизводительного низкоэнергоматериалоемкого способа поляриметрического определения крахмала. Предлагаемый способ определения крахмала, решающий указанную задачу, состоит в том, что гомогенизацию материала проводят в пенициллиновых флаконах в растворе серной кислоты, гидролиз крахмала проводят в тех же герметически закупоренных флаконах,помещенных в блок-контейнер при температуре кипящей воды, а измерение оптической активности раствора - в открытой призматической кювете на поляриметре. Физическая сущность способа заключается в использовании принципа конечного объема, исключающего дальнейшие разведения и добавления реактивов в анализируемый раствор, вследствие гидролиза материала более слабой кислотой в замкнутом пространстве. Принцип реализуется посредством герметической закупорки сосуда, в котором идет гидролиз серной кислотой растительного материала пробкой, которая удерживается от выбрасывания при нагревании сосуда на кипящей водяной бане привинченной крышкой блок-контейнера. Серную кислоту для гидролиза крахмала предлагается использовать как более слабую по сравнению с соляной, о чем свидетельствуют константы диссоциации этих кислот-107 24 - (1)103, (2)10-2. Была проведена серия опытов по подбору оптимальной концентрации кислоты и времени гидролиза растительного материала. Использование 1, 2 и 3 -ных растворов 24 для гидролиза крахмала муки тритикале показало, что угол вращения плоскости поляризации составил соответственно 28,1, 28,8 и 28,2. Под влиянием 2 -ной кислоты гидролиз крахмала протекал полностью и не приводил к сопутствующему существенному гидролизу белков, так как при этом не наблюдалось возникновения опалесценции, как в случае с , что позволяет исключить процедуру осаждения белковых веществ для осветления раствора. Величина угла вращения плоскости поляризации при кипячении образцов 10 и 15 мин составила 28,4 и 28,8 соответственно. Увеличение времени кипячения до 20 мин и более привело к возникновению опалесценции и необходимости осветления гидролизатов. Использование 2 -ного раствора серной кислоты является наиболее оптимальным, так как при 1 -ном растворе часто наблюдалось залипание клейстеризующейся суспензии, что приводило к неполному гидролизу крахмала, а при 3 -ном - к более глубокому гидролизу, чем это необходимо. Однако в ряде случаев при использовании даже 2 -ной 24 отмечалось залипание клейстеризующейся суспензии некоторых образцов муки овса и тритикале. Это объясняется тонкими особенностями биохимического состава и технологических свойств муки таких образцов. Для устранения этого явления необходима долго не оседающая тонкая суспензия, для получения которой требуется специализированный гомогенизатор. При предлагаемом способе резко снижается время проведения анализа за счет одновременного гидролиза большого количества образцов, помещенных в блок-контейнер, исключения промежуточных операций по приливанию реактивов, доведению объема и использования открытой призматической кюветы. Пример реализации предлагаемого способа. Навеску муки исследуемого образца (250-500 мг) помещают в пенициллиновый флакон и заливают 5 мл 2 -ного раствора 24. При анализе клубней (картофель, топинамбур и др.) вырезают кубик ткани, взвешивают его, помещают в пенициллиновый флакон и гомогенизируют 2-3 мин, добиваясь однородности суспензии с помощью микрогомогенизатора (фиг. 1, 2). 15229 1 2011.12.30 На фиг. 2 показана принципиальная схема устройства микрогомогенизатора, который состоит из корпуса 1, электродвигателя 2, ротора с лопастями 3, 4, 5, окна в корпусе 6 и включателя 7. На фиг. 3, 4, 5 показан блок-контейнер для проведения анализа. Флаконы закупоривают пробками и помещают в специальный контейнер для кипячения 12. Контейнер представляет собой алюминиевый цилиндрический блок с девятнадцатью гнездами для флаконов 2, с тремя шпильками 6, 7, 8. Сверху блок закрывается крышкой 3 с резиновой прокладкой 9, 10, 11, которая закрепляется с помощью винтов, навинчиваемых на шпильки, проходящие через крышку. Крышка имеет ручку 4, 5 для удобного помещения и извлечения блока из кипящей водяной бани. Контейнер с подготовленными к анализу пенициллиновыми флаконами помещают в кипящую водяную баню на 15 мин с момента ее вторичного закипания. После протекания гидролиза контейнер охлаждают и раствор фильтруют в аналогичные флаконы через бумажный фильтр белая или синяя лента. Фильтрат заливают в 10-сантиметровую цилиндрическую поляриметрическую кювету и определяют угол вращения поляризованного луча (фиг. 6, 7). Предлагаемая микрокювета позволяет проводить анализ малых (3-5 см 3) объемов оптически активных растворов. Кювета имеет открытый прямоугольный канал 2, ограниченный с двух сторон прозрачными стеклами 3. Корпус кюветы 1 призматической формы,изготовлен из органического стекла. Длина кюветы составляет 100 мм, ширина - 20 мм и высота - 23 мм. С узкой стороны призмы по всей ее длине сделан канал глубиной 10 мм и шириной 5 мм, поверхности которого отполированы. С торцов канал заклеен прозрачными стеклами. Снизу кювета по концам имеет две опоры полукруглой формы, на которые она ставится при помещении ее в трубчатый корпус поляриметра. Опоры в корпусе сделаны в результате удаления материала центральной части нижней стороны кюветы на глубину 5 мм, причем удаление не доходит до краев кюветы на 10-15 мм. В кювету наливают раствор так, чтобы уровень жидкости составлял 0,6-0,8 высоты канала. Это приблизительно 3-5 мл. Кювету с раствором помещают в поляриметр и определяют угол вращения поляризованного луча. Можно для определения крахмала пользоваться принятыми для поляриметрии формулами. Сравнительный анализ контрольных растворов крахмала в стандартной цилиндрической кювете и предлагаемой, с открытым призматическим каналом, показал полную идентичность отсчета поляриметра (табл. 1). При поляриметрическом анализе малых объемов оптически активных растворов достигается экономия реактивов, сокращение времени прохождения анализа на 20-50 и улучшение санитарно-гигиенических условий труда. Предлагаемый метод характеризовался хорошей сходимостью результатов при определении содержания крахмала в семенах овса, ячменя, пшеницы, ржи, тритикале и в клубнях картофеля по сравнению со стандартным методом (табл. 2). Таблица 1 Определение угла вращения растворов крахмала в разных кюветах Отсчет поляриметра при содержании крахмала Тип кюветы 4,05,06,07,0 Цилиндрическая - контроль 18,1 22,6 27,3 31,8 Призматическая - экспериментальная 18,7 22,4 27,5 31,6- среднее по 5 отсчетам. 15229 1 2011.12.30 Таблица 2 Содержание крахмалав семенах и клубнях сельскохозяйственных культур,определенное стандартным и экспресс-микрометодом Определение экспрессКультура Определение по Эверсу микрометодом Ячмень 56,8 56,2 Овес 51,3 51,8 Тритикале 62,2 61,4 Горох 36,7 37,8 Соя 4,5 4,4 Люпин 11,6 11,3 Картофель 17,5 17,1- отсутствие различий со стандартом при 0,05. При расчете процентного содержания крахмала в муке используют калибровочную прямую, полученную при анализе заданных навесок зернового крахмала предлагаемым экспресс-микрометодом. Калибровочный график для расчета крахмала в муке Предлагаемый способ определения крахмала повышает производительность труда,делает его экологически более чистым и безопасным и, кроме того, позволяет работать с селекционными образцами на ранних этапах селекционного процесса. Источники информации 1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И. и др. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И.Ермакова. - Л. Колос, 1972. - С. 160-162. 2. ГОСТ 10845-98. Зерно и продукты его переработки. Метод определения крахмала. Минск, 2000. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6