Питательная среда для культивирования кампилобактерий

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАМПИЛОБАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Титов Леонид Петрович Газимуарова Людмила Дмитриевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(56)1386657 1, 1988. Инструкция 4.2.10-17-7-2006. Клиническая и лабораторная диагностика кампилобактериоза. - Минск, 2006. АЛИЕВА Е.В. Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза Автореферат диссертации. - М., 2008. С. 9-10.2059714 1, 1996.93003275 , 1997. Справочник заведующего // КДЛ. 2009. -4. - С. 50-62. Справочник ветеринарного лаборанта. М. Колос, 1981. - С. 41-42.6077678 , 2000.2086648 1, 1997.(57) Питательная среда для культивирования кампилобактерий, содержащая источник азотного питания, натрия хлорид, натрия карбонат, агар-агар и дистиллированную воду,отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания содержит пептон для бактериологических питательных сред и дополнительно содержит дрожжевой экстракт сухой при следующем соотношении компонентов, г/л пептон для бактериологических питательных сред 20,0-24,0 натрия хлорид 4,0-6,5 натрия карбонат 1,0-1,5 агар-агар 10,0-12,0 дрожжевой экстракт сухой 5,0-6,0 вода дистиллированная до 1 л,и имеет 7,20,2. Изобретение относится к медицинской и санитарной микробиологии и может быть использовано при диагностике кампилобактерий из различных клинических источников,объектов внешней среды и пищевых продуктов. Источником инфекции кампилобактериозов являются многие виды животных, чаще дикие и домашние птицы, в первую очередь куры. 14469 1 2011.06.30 Ведущими зарубежными фирмами , ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск, РФ, НПО Питательные среды, г. Махачкала, выпускаются питательные среды для культивирования и выделения кампилобактерий на основе гидролизатов казеина 2,кильки 3, пептона протеина с добавлением электролита 1. Наиболее близкой к предлагаемой среде является питательная среда для культивирования кампилобактерий 4, содержащая триптический гидролизат кормовых дрожжей,стимулятор роста натрия пируват, натрия глютамат, натрия метабисульфит, железо сернокислое закисное, натрий хлористый, натрий углекислый, агар и воду. Недостатками этой среды являются специфичный состав, сложность в приготовлении,слабые вегетирующие и селективные свойства в отношении кампилобактерий. Отсутствие отечественных питательных сред для диагностики кампилобактериозной инфекции вызывает нарекания со стороны практической службы здравоохранения. Задачей изобретения является создание питательной среды для культивирования и выделения кампилобактерий, обеспечивающей стабильность результатов, по бактериологическим показателям не уступающей зарубежным аналогам. Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования кампилобактерий, содержащая источник азотного питания, натрия хлорид, натрия карбонат,агар-агар и дистиллированную воду, в качестве источника азотного питания содержит пептон для бактериологических питательных сред и дополнительно содержит дрожжевой экстракт сухой и натрия карбонат при следующем соотношении компонентов, г/л пептон для бактериологических питательных сред 20,0-24,0 натрия хлорид 4,0-6,5 натрия карбонат 1,0-1,5 агар-агар 10,0-12,0 дрожжевой экстракт сухой 5,0-6,0 вода дистиллированная до 1,0 л,и имеет рН 7,20,2. Пептон для бактериологических питательных сред выпускает Научно-исследовательский центр фармакотерапии (С.-Петербург). Его получают из рубцов, летошки крупного рогатого скота и мяса кур. Среда автоклавируется при 1 атм (121 С) в течение 15 минут. Количественное соотношение компонентов питательной среды и 7,20,2 обеспечивают типичный рост культур. через (444) часов инкубации при 42 С в микроаэрофильных условиях при посеве минимальных посевных доз (0,1 мл из разведения 10-6-10-7). Изобретение иллюстрируют следующие примеры. Пример 1 Для изготовления среды берут следующие навески ингредиентов, г пептон для бактериологических питательных сред 20,0 натрия хлорид 4,0 натрия карбонат 1,0 дрожжевой экстракт 5,0 агар бактериологический 10,0 вода дистиллированная до 1,0 л,рН 7,20,2. Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, кипятят 1-2 мин, автоклавируют при 121 С в течение 15 минут. Для придания селективных свойств к среде добавляют смесь, состоящую из 3-х антибиотиков полимиксин 1250 , ванкомицин - 5 мг, триметоприм - 2,5 мг. Антибиотики смешивают и помещают в отдельный флакон. Смесь рассчитана на приготовление 0,5 литров среды. Перед употреблением в расплавленную и остуженную до 45-50 С основу питательной среды добавляют 5,0-7,0 дефибринированной крови человека, барана, лошади и затем растворенную 2 14469 1 2011.06.30 в стерильной дистиллированной воде (5 мл) смесь антибиотиков. Содержимое осторожно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 20-25 мл. Перед посевом среду подсушивают при (371,0) С в течение 30 минут. Предлагаемая среда обеспечивает рост следующих тест-штаммов(клинический изолят),при посеве 0,1 мл микробной взвеси каждой культуры из разведения 10-6 через 48 часов инкубации при (42,00,5) С в микроаэрофильных условиях (анаэростатах, эксикаторах,свечных сосудах с использованием газогенерирующих пакетов). Наиболее эффективно использование 2-инкубатора. Бактерииобразуют на среде бесцветные или светло-серые колонии 12 мм в диаметре, не способные к гемолизу. При более длительном культивировании центр их несколько уплотняется, они приобретают желтоватый оттенок. При небольшом количестве кампилобактерий может быть сплошной рост в виде влажной, прозрачной пленки на поверхности питательной среды. Результаты бактериологического контроля среды представлены в табл. 1. Пример 2 Среду готовят в соответствии с примером 1. пептон для бактериологических питательных сред 22,0 натрия хлорид 5,3 натрия карбонат 1,2 дрожжевой экстракт 5,5 агар бактериологический 11,0 вода дистиллированная до 1,0 л, 7,20,2. Результаты бактериологического контроля представлены в табл. 1 и аналогичны результатам проверки по примеру 1. Пример 3 Среду готовят в соответствии с примером 1. пептон для бактериологических питательных сред 24,0 натрия хлорид 6,5 натрия карбонат 1,5 дрожжевой экстракт 6,0 агар бактериологический 12,0 вода дистиллированная до 1,0 л, 7,20,2. Результаты бактериологического контроля представлены в табл. 1 и аналогичны результатам проверки по примеру 1. Пример 4 Среду готовят в соответствии с примером 1. пептон для бактериологических питательных сред 18,0 натрия хлорид 3,0 натрия карбонат 1,0 дрожжевой экстракт 4,0 агар бактериологический 9,0 вода дистиллированная до 1,0 л, 7,20,2. 14469 1 2011.06.30 Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению ее ростовых свойств. Результаты бактериологического контроля представлены в табл. 1. Пример 5 Среду готовят в соответствии с примером 1. пептон для бактериологических питательных сред 26,0 натрия хлорид 7,5 натрия карбонат 2,0 дрожжевой экстракт 6,5 агар бактериологический 13,0 вода дистиллированная до 1,0 л, 7,20,2. Результаты бактериологического контроля представлены в табл. 1 и аналогичны результатам проверки по примеру 4. Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда, приготовленная в соответствии с примерами 1, 2, 3, обладает хорошими ростовыми свойствами, обеспечивая рост культур типичной морфологии колонии кампилобактерий слегка выпуклые светло-серого цвета, 1-2 мм в диаметре, гомогенны. Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению микробиологических показателей качества препарата. Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается уменьшение числа и размера колоний. Кроме того, снижение числа колоний способствует образованию сплошной прозрачной пленки на поверхности питательной среды (пример 5), которая препятствует выделению культуры при наличии роста контаминантной микрофлоры. Таблица 1 Предлагаемая среда по примеру Тест-штаммы 1 2 3 4 5 4,3 48 40 37 30. (кли 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 0,8-1,0 нический светлосветло-серые светло-серые светло-серые сплошной рост изолят) черные прозрачные прозрачные прозрачные 61,0-1,5 1,0-1,5 1,5-2,0 0,8-1,0 сплошной ростколичество выросших колонийразмер колоний. Сравнительные данные роста культур на разработанной среде и среде-прототипе представлены в табл. 2. Таблица 2 Оценка эффективности сухой питательной среды по сравнению со средой-прототипом Предлагаемая среда Среда-прототип стабильность стабильность скорость скорость основных основных чувствительность роста,чувствительность роста,биологических биологических час час свойств свойств сохраняет при сохраняет при 10-6 40-48 пересевах до 10-6 48-72 пересевах до 6-8 пассажей 3-6 пассажей сохраняет при сохраняет при-6 10 40-48 пересевах до 10 48-72 пересевах до 6-8 пассажей 3-6 пассажей сохраняет при сохраняет при 10-7 40-48 пересевах до 10-6 48-72 пересевах до 6-8 пассажей 3-6 пассажей сохраняет при сохраняет при 10-6 40-48 пересевах до 10-6 48-72 пересевах до 6-8 пассажей 3-6 пассажей Из таблицы видно, что как чувствительность, так и скорость роста на предлагаемой среде выше по сравнению со средой-прототипом. Кроме того, на предлагаемой среде сохраняются все основные биологические свойства популяции (морфология, антигенные и биохимические свойства) при более длительных пересевах (пассажах). Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ сокращает время инкубации до 48 часов вместо 72 часов на среде-прототипе, что позволяет ускорить предварительный диагноз обладает высокой чувствительностью, обеспечивает стабильные ростовые свойства исследуемого возбудителя, поэтому с успехом может быть использована не только в клинической, но и санитарной микробиологии доступность и низкая стоимость по сравнению с импортными средами позволяет более успешно решать задачи диагностики и лечения заболеваний, вызванных этим возбудителем. Источники информации 1. Каталог Бактериологические среды для санитарной и клинической микробиологии,биотехнологии и контроля лекарственных средств. - г. Оболенск, 1999. - С. 27. 2. Справочник по микробиологическим питательным средам / Под ред. М.М.Меджидова. - Махачкала Дагестан кн. изд-во, 1999. - С. 33. 3., , 1996/97, . 77. 4. СССР 1386657, МПК 12 1/20 // Бюл.13. - 1988. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5