Способ получения нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Дубовская Людмила Вячеславовна Колеснева Екатерина Владимировна Содель Дмитрий Леонидович Волотовский Игорь Дмитриевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ получения нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья, включающий гомогенизацию листьев растений и хроматографическое выделение целевого продукта, отличающийся тем, что растительное сырье гомогенизируют при 0-4 С в 50 мМ глицерофосфатном буфере с 7,4, содержащем 20 мМ ЭДТА, 15 мМ 2, 1 мМ ДТТ и 5 мМ , с добавлением 1(мас./объем) поливинилполипирролидона, 1(мас./мас.) коктейля для ингибирования растительных протеаз, 500 мкМ 34, 10 мкМ 44 и 2 мМ ДТТ, при соотношении массы растительного сырья в г к объему среды в мл, равном 12, полученный гомогенат разделяют центрифугированием и из полученной цитозольной фракции выделяют целевой продукт с помощью аффинной хроматографии на колонке с 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3,5-цикломонофосфат-агарозой, причем все операции аффинной хроматографии, за исключением десорбции белков, проводят при 20-25 С. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование гомогената осуществляют при (100000-125000) в течение 30-40 минут. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что десорбцию белков ведут раствором гуанозин-3,5-цикломонофосфата при 0-4 С. Изобретение относится к области промышленности биоактивных веществ, а именно к производству диагностических и лекарственных противоопухолевых препаратов из растительного сырья, и может быть использовано в химических и биотехнологических производствах, медицине и фармацевтической промышленности. 13564 1 2010.08.30 Нуклеозиддифосфаткиназа (НДФК 2.7.4.6, нуклеозиддифосфатфосфотрансфераза нуклеозиддифосфаткиназа) представляет собой фермент, катализирующий перенос фосфатного остатка (-фосфата, Ф) от нуклеозидтрифосфатов (Н 1 ТФ, преимущественно АТФ) к 5-нуклеозиддифосфатам (Н 2 ДФ) по следующей схеме Н 1 ТФФерментН 1 ДФФерментФ ФерментФН 2 ДФН 2 ТФФермент Н 1 ТФН 2 ДФН 1 ДФН 2 ТФ и, таким образом, выполняющий ключевую роль в поддержании физиологических концентраций нуклеозидтрифосфатов в клетке. Изоформы НДФК присутствуют во всех эукариотических клетках (грибы, растения и животные). Нуклеозиддифосфаткиназная активность обнаружена в ряде клеточных компартментов, таких как цитозоль, митохондрии, микросомы и хлоропласты. В клетках животных и человека НДФК участвует в контроле клеточного деления и регуляции транскрипции жизненноважных генов. Было обнаружено, что НДФК человека подавляют метастатический потенциал опухолей 1. Оказалось, что растения обладают высоким запасом экстрагируемой НДФК. В растениях присутствие НДФК обнаружено во всех вегетативных и репродуктивных органах и тканях корнях, листьях, клубеньках и клеточных культурах. Известно, что в растениях изоформы нуклеозиддифосфаткиназы принимают участие в важных регуляторных процессах, таких как фоторецепторная фитохромная сигнализация и формирование УФответа, выступая в роли позитивного фактора транскрипции, а также в стрессовой сигнализации при тепловом и окислительном шоке и механическом повреждении. Наибольшая активность НДФК в растениях регистрируется в цитоплазматической фракции (81-85 ),где она представлена изоформой НДФК 1. В литературе описано несколько способов выделения НДФК из растительных объектов, однако нет эффективного способа выделения растворимой цитоплазматической НДФК из растений. В связи с относительно легкой доступностью и простотой использования растительных объектов способ выделения и очистки цитоплазматической НДФК из растительной ткани является актуальным для применения в научных лабораториях, на химическом и фармакологическом производстве. Известен способ получения НДФК из грубого экстракта корней свеклы 2, который состоит из стадий получение грубого экстракта из корней свеклы путем проведения гомогенизации ткани и фильтрование гомогената через ткань выделение НДФК путем проведения преципитации белков с помощью сульфата аммония, диализа, центрифугирования,ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе с градиентной элюцией, диализа и хроматографии на гидроксиапатите с градиентной элюцией диализ. Выход активной фракции по белку составляет 1,8 . Недостатком способа является трудоемкость и многоэтапность процесса выделения,включающего несколько стадий хроматографии и сложный многоступенчатый процесс элюции, что снижает выход продукта и уровень рентабельности производственного процесса, требует больших затрат времени и тем самым затрудняет его использование в производстве. Наиболее близким является способ получения НДФК из митохондрий 3, включающий получение чистой фракции хлоропластов или митохондрий путем проведения следующих стадий гомогенизация ткани, фильтрование гомогената через ткань,центрифугирование фильтрата, центрифугирование осадка в градиенте плотности, отмывание отобранной митохондриальной фракции центрифугированием выделение НДФК путем проведения экстрагирования белка осмотическим разрушением, центрифугирования, ультрафильтрации, диализа, аффинной хроматографии на АТФ-агарозе с градиентной элюцией, ультрафильтрации, диализа, ионообменной хроматографии на-геле с градиентной элюцией диафильтрацию. Выход активной фракции по белку составляет 2,6 . 2 13564 1 2010.08.30 Недостатком известного способа является трудоемкость и многоэтапность процесса выделения, включающего использование нерационального объекта, обладающего сложностью получения из сырья и невысоким содержанием целевого продукта, несколько стадий хроматографии и сложный многоступенчатый процесс элюции, что снижает выход продукта и уровень рентабельности производственного процесса, требует больших затрат времени и тем самым затрудняет его использование в производстве. В основу изобретения положена задача создания эффективного способа получения нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья. Технический результат - сокращение времени получения фермента, повышение выхода целевого продукта и рентабельности производственного процесса. Поставленная задача решается следующим образом. Известный способ получения нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья включает гомогенизацию листьев растений и хроматографическое выделение целевого продукта. Согласно изобретению, растительное сырье гомогенизируют при 0-4 С в 50 мМ глицерофосфатном буфере с 7,4,содержащем 20 мМ ЭДТА, 15 мМ 2, 1 мМ ДТТ и 5 мМ , с добавлением 1(мас./объем) поливинилполипирролидона, 1(мас./мас.) коктейля для ингибирования растительных протеаз, 500 мкМ 34, 10 мкМ 44 и 2 мМ ДТТ, при соотношении массы растительного сырья в г к объему среды в мл, равном 12, полученный гомогенат разделяют центрифугированием и из полученной цитозольной фракции выделяют целевой продукт с помощью аффинной хроматографии на колонке с 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин 3,5-цикломонофосфат-агарозой, причем все операции аффинной хроматографии, за исключением десорбции белков, проводят при 20-25 С. Центрифугирование гомогената осуществляют при (100000-125000) в течение 3040 минут. Десорбцию белков ведут раствором гуанозин-3,5-цикломонофосфата при 0-4 С. Существенными отличительными признаками изобретения являются использование цитозольной фракции и выделение целевого продукта с помощью аффинной хроматографии на колонке с 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3,5-цикломонофосфат-агарозой, обладающей повышенными аффинными свойствами лиганда. Что позволило сократить время получения фермента и повысить выход целевого продукта. Гомогенность препарата доказана с помощью ДСН-гель-электрофореза, изоэлектрофокусирования и масс-спектрометрии. Данный способ позволяет получать достаточное количество цитозольной нуклеозиддифосфаткиназы из различных растений. Пример Для получения нуклеозиддифосфаткиназы брали 5 г листьев овса, который гомогенизировали в 10 мл 50 мМ глицерофосфатного буфера с 7,4, содержащего 20 мМ ЭДТА,15 мМ 2, 1 мМ 1,4-дитиотрейтола (ДТТ) и 5 мМ(буфер А), с добавлением 1(мас./объем) поливинилполипирролидона, 1(мас./мас.) коктейля для ингибирования растительных протеаз, 500 мкМ 34, 10 мкМ 44 и 2 мМ ДТТ (буфер Б), при соотношении массы растительного сырья (г) к объему (мл) среды, как 12. Гомогенат фильтруют через ткань и осветляют центрифугированием при 113000 30 минут. Супернатант используют в качестве фракции растворимых цитозольных белков для аффинной хроматографии. Все операции проводят при температуре от 0 до 4 С. Экстракт растворимых белков, содержащий 4,5 мг общего белка, наносят на колонку, заполненную 600 мкл 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3,5-цикломонофосфат-агарозы (8-АЕТ-цГМФ-агарозы), в которой 8-АЕТ-цГМФ мобилизован в качестве аффинного лиганда. Колонку с гелем предварительно уравновешивают 6 мл буфера А (100-200 мкл/мин) при 25 С. После промывания 30 мл буфера А (200 мкл/мин) связанные белки элюируют при 4 С в течение 15 часов путем инкубации в 1,2 мл буфера А, содержащего конкурентный 10 мМ цГМФ. Элюат собирают и с целью смены буфера подвергают диализу против 25 мМ Трис- буфера с 3 13564 1 2010.08.30 7,5 с содержанием 1 мМ -меркаптоэтанола с использованием диализных пробирок (2 мл 3,5 кДа). Фракцию помещают во флакон и высушивают лиофилизацией. Выход активной фракции по белку составляет 0,5 мг (11 ). Предлагаемый способ обеспечивает получение нуклеозиддифосфаткиназы из любого растительного сырья с использованием одной стадии хроматографии и одноступенчатой элюции, сокращает время выделения фермента, позволяет повысить его выход и повышает рентабельность производственного процесса. Источники информации 1. Патент США 6518062, МПК 12 15/09, 1993. 2... ,2// ..- 2007.- . 164.- . 113-1123. 3...// - 1999.- . 262 765-773. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4