Способ гидролиза белка

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна Шатило Нина Лукинична Шнып Ирина Викторовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56) Питательные среды в медицинской микробиологии Руководство по изготовлению питательных сред для микробиологических институтов и санитарнобактериологических лабораторий. Москва МЕДГИЗ, 1950. - С. 51-53.2020153 1, 1994.2084172 1, 1997.2132142 1, 1999.(57) Способ гидролиза белка, включающий добавление измельченной ткани или экстракта поджелудочной железы к водно-солевому раствору белка и инкубирование при 37 С, отличающийся тем, что в качестве водно-солевого раствора используют 0,0075-0,06 М фосфатный буфер 7,2, содержащий 24 и 24. Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано при производстве микробиологических питательных сред, содержащих гидролизаты белков. Известен способ панкреатического гидролиза белков, включающий приготовление водно-солевого раствора или взвеси белков, добавления измельченной ткани или экстракта поджелудочной железы и инкубирование при 37 С 1. Указанный способ является прототипом в отношении заявляемого. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является приготовление водно-солевого раствора или взвеси белков, добавление измельченной ткани или экстракта поджелудочной железы и инкубирование при 37 С. Однако недостатком прототипа является недостаточно глубокое и интенсивное расщепление белков. Задачей заявляемого способа является увеличение глубины и интенсивности расщепления белков. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ гидролиза белка, включающий добавление измельченной ткани или экстракта поджелудочной железы к водно-солевому раствору белка и инкубирование при 37 С, при этом в качестве водно-солевого раствора используют 0,0075-0,06 М фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 24 и КН 2 РО 4. Использование в качестве растворителя раствора солей неорганического ортофосфата позволяет интенсифицирофать расщепление белков и увеличить его глубину при проведении гидролиза экстрактами и тканью поджелудочной железы. 11529 1 2009.02.28 Пример 1 Расщепление растворов белков экстрактами поджелудочной железы. В 3 пробирки вносили по 100 мг в первую - казеина по Гаммерстену, во вторую - гемоглобина быка, в третью - желатина (, Германия), добавляли дистиллированную воду до объема 10 мл и перемешивали содержимое до растворения белков (контрольные пробы). В следующие семь групп пробирок, по 3 в каждой группе, вносили такое же количество одного из указанных белков, добавляли растворы фосфатного буфера рН 7,2 до объема 10 мл и перемешивали содержимое до растворения белков (опытные пробы). При этом концентрация ортофосфата в первой опытной группе была 0,06 М, во второй - 0,03 М, в третьей - 0,015 М, в четвертой - 0,0075 М, в пятой - 0,00375 М, в шестой - 0,00186 М. Для гидролиза использовали экстракт поджелудочной железы быка навеску ткани измельчали, добавляли 2,5 части дистиллированной воды, 1 часть этанола и оставляли при комнатной температуре. Через 3 суток фильтровали через капроновую сетку и использовали в работе. Интенсивность гидролиза белков регистрировали методом лизиса в тонком слое агарового геля 2. Для этого из полученных растворов белков готовили белок-агаровые пластины, на которые наносили аликвоты экстракта поджелудочной железы микродозатором по 10 мкл. Затем инкубировали белок-агаровые пластины с нанесенным на поверхность экстрактом поджелудочной железы при 37 С в течение 24 часов. После этого обрабатывали все пластины 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряли площадь зон расщепления белков. Результаты сведены в таблицу 1. Таблица 1 Расщепление белков экстрактом поджелудочной железы(в мм 2 зон лизиса белкового субстрата,4) Испытуемый вариант Прототип (контроль) 46221 879 67030 Заявляемый способ добавка солей ортофосфата 0,060 М 65925 25217 69329 0,030 М 78440 22914 68826 0,015 М 63821 22920 100840 0,0075 М 56019 16813 93835 0,00375 М 52120 12410 51820 0,00186 М 50025 799 66029 Р 0,05. Из материалов таблицы видно, что соли неорганического ортофосфата усиливают панкреатический гидролиз казеина в 1,7-1,2 раза при концентрации 0,060-0,0075 М, гидролиз гемоглобина в 2,9-1,4 раза при той же концентрации, а гидролиз желатина в 1,5-1,4 раза при концентрации 0,015-0,0075 М. Уменьшение концентрации ортофосфата за пределы заявляемого диапазона ухудшает результат. Увеличение концентрации не приводит к улучшению результата. Пример 2 Белоксодержащее сырье. Белоксодержащее сырье, например вываренный говяжий фарш, помещали в бутыль,добавляли дистиллированную воду и свежеизмельченную железу. Смесь подщелачивали 20 растворомдо рН 7,8, добавляли хлороформ (3 от объема смеси), бутыль с содержимым инкубировали при 37 С при периодическом перемешивании смеси (прототип). 2 11529 1 2009.02.28 В другие 3 бутыли (опыт) вносили те же компоненты, однако дистиллированную воду заменяли водным раствором солей неорганического ортофосфата при концентрации первая бутыль - 0,06 М, вторая бутыль - 0,03 М и третья бутыль - 0,015 М. Эти бутыли с содержимым инкубировали также при 37 С при периодическом перемешивании. Ежедневно отбирали аликвоты взвеси, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин и в надосадочной жидкости определяли уровень низкомолекулярной пептидной фракции и остаточного белка 3, кислоторастворимого триптофана 4. Результаты испытаний сведены в таблицу 2. Как видно из материалов таблицы, в присутствии солей неорганического ортофосфата уже в первые сутки происходит переход большего, чем в прототипе, количества белка в растворимую фазу в 1,1 раза. Затем вследствие расщепления уровень его уменьшается,особенно заметно при концентрации солей ортофосфата 0,015 М. Снижение уровня белка в прототипе составляет 2,5 г/л, а в этом варианте - 5,0 г/л. Вследствие расщепления белка накапливаются низкомолекулярные пептиды, триптофан, уровень которых на четвертые сутки гидролиза в заявляемом способе превышает прототип в 1,45-1,82 раза (низкомолекулярные пептиды) и в 1,42-2,60 раза (триптофан). Это подтверждает более глубокое расщепление белков в заявляемом способе в сравнении с прототипом. Изменения концентрации ортофосфата за пределы указанных не улучшают результат. Таблица 2 Изменения уровня белково-азотистых компонентов надосадочной жидкости панкреатических гидролизатов говяжьего фарша (3) Испытуемый вариант Прототип (контроль) 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки Заявляемый способ добавка солей ортофосфата 0,06 М 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 0,03 М 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 0,015 М 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки Таким образом, достигаемый результат заключается в том, что способ позволяет интенсифицировать (усилить) расщепление белков экстрактами или тканью поджелудочной железы. Данный способ может найти широкое применение при производстве микробиологических питательных сред, содержащих гидролизаты белков. 3 11529 1 2009.02.28 Источники информации 1. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. - М.-Л. Медгиз,1950. - С. 51-53 (прототип). 2. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шатило Н.Л. Протеолитическая и эндонуклеазная активность штаммовпри росте на питательных средах сложного состава. . Нейтральные деполимеразы // Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медико-экологические аспекты проблемы Матер. междунар. конф. - Минск, 2002. - . 326-342. 3. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. / Рунова В.Ф., Бендас Л.Г., Максимова Г.А. и др. - М., 1997. - . 4-6. 4. Горнак И.М., Получанов , Дуксина В.В., Коваленко С.П. Содержание незаменимых аминокислот в биомассе некоторых почвенных микроорганизмов // Микробы и их метаболиты. - 1974. - . 130-138. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4