Способ получения 125I-меченного белка

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Макаренко Михаил Васильевич Усанов Сергей Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56)1588141 1, 1991.1767434 1, 1992.4430318, 1984. Макаренко М.В. и др. Весц нацыянальнай акадэм навук Беларус Сэрыя хмчных навук. - 2001. -1. - С. 60-62.(57) 1. Способ получения 125-меченного белка, включающий окислительное радиоиодирование белка изотопом 125 в водном буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий от 5 до 30 спирта. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве спирта используют метанол,изопропанол, изобутанол, бутанол или глицерин. 10117 1 2007.12.30 Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к усовершенствованному способу получения 125-меченного белка, который может быть использован в качестве радиомаркера в биохимических исследованиях и в радиоиммунологическом анализе. Известен способ получения 125-меченных белков методом окислительного радиоиодирования с хлорамином Т (ХАТ) 1. Радиоиодирование сводится к смешению растворов белка, иодида натрия (125) и хлорамина Т. Навески белка и хлорамина Т растворяют в водных буферных растворах (рН 7,5). Реакцию иодирования останавливают добавлением в реакционную смесь восстановителя метабисульфита натрия. Недостаток метода - нежелательные побочные реакции хлорирования, окисления тиоэфирной и сульфгидрильной групп аминокислот, разрушения пептидных связей, что делает неадекватными свойства меченого и исходного лигандов 2, 3. Для уменьшения побочных реакций данного метода используют дополнительные протекторные вещества формулы 2, где- низший алкил, фенил, бензил или толил 4. Производные сульфоксидов в качестве ловушек защищают чувствительные остатки аминокислот в гормонах от перекисного окисления при химическом иодировании с хлорамином Т. Протектор вносят в количестве от 0,1 до 11 мг на микрограмм гормона, до внесения хлорамина Т. Недостаток - метод не позволяет увеличить связывание выше 51,5-52,6 . Наиболее близким к заявляемому является способ получения меченых белков окислительным радиоиодированием в присутствии сульфоксидов 5 (прототип). Мечение хорионического гонадотропина проводят в водном буферном растворе с 1 мкКи 125 в присутствии 50 мкл диметилсульфоксида. Вносят 500 мкг хлорамина Т и перемешивают в течение 1 минуты. Останавливают реакцию внесением 240 мкг метабисульфита натрия. Эффективность включения метки составляет 40-48 . Недостатки метода применение сульфоксидов в качестве протекторов требует использования больших количеств окислителя (150-500 мкг хлорамина Т) и соответственно метабисульфита натрия метод не позволяет достичь высокой эффективности включения изотопа. Задачей изобретения является усовершенствование способа получения 125-меченного белка, приводящее к увеличению включения изотопа в белок. Поставленная задача решается заявляемым способом окислительного радиоиодирования белка изотопом 125 в водном буферном растворе, который отличается тем, что в качестве буферного раствора используют натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий от 5 до 30 спирта. В качестве спирта используют низкомолекулярные спирты различной природы метанол, этанол, изопропанол, изобутанол, бутанол, глицерин. Спиртовой ингредиент вносится в реакционную среду вместо сульфоксидов. Спирты, как и диметилсульфоксид, являются -донорными растворителями и, следовательно, обладают основными свойствами, они отлично сольватируют катионы. Установлено, что проведение радиоиодирования в спиртосодержащей среде приводит к увеличению включения изотопа в 1,3-2 раза по сравнению с контролем(без спирта) при иммунореактивности получаемых меченых белков 93-98 . В отличие от способа-прототипа метод позволяет использовать значительно меньшее количество хлорамина Т 2 мкг и 150-500 мкг в прототипе, т.е. в 75-250 раз менее. Использование водноспиртовых буферных растворов позволяет увеличить растворимость паров иода в реакционной среде, уменьшить его выброс в воздух рабочего помещения. Известно, что газообразный 1252 является элементом с высокой радиотоксичностью,относится к группе радиационной опасности Б. Радиоактивный газообразный иод обладает высокой летучестью, образуется при окислении 125 с хлорамином Т. При радиоиодировании хлораминовым методом с использованием 18,5 МБк 125 выделяется 3722 кБк газообразного 1252 6. Минимизация выброса уменьшает степень радиоактивного загрязнения оборудования и уровень облучения работающего персонала, обеспечивает поддержание требуемого уровня радиационной безопасности. 10117 1 2007.12.30 Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 показана зависимость включения изотопа 125 в бычий сывороточный альбумин от концентрации изопропанола и времени реакции ( 10 с,30 с,60 с, 120 с) на фиг. 2 показана зависимость включения изотопа 125 в гамма-глобулин кролика от времени реакции и используемого спирта. Обозначения по оси 1-контроль, без спирта 2-этанол, 203-метанол, 304-изопропанол, 205-бутанол, 106-избутанол,107-глицерин, 10 . Данные показывают, что растворитель не является инертной средой, в которой проводится мечение. По сравнению с контролем (без спирта) включение возрастает по мере увеличения содержания изопропанола в реакционной среде (фиг. 1) до максимума при концентрации 20(включение 81,7 , контроль 61,4 ), при 30- 78 , дальнейшее увеличение в меньшей степени влияет на включение. Метанол и этанол оказывают меньшее влияние по сравнению с изопропанолом (фиг. 2). Максимальное включение при их концентрации 20 составляет 74,5 , 76,0 и 83,5 , контроль 62,6 . Вносит свой вклад и природа используемых спиртов при равной концентрации спирта (10 ) бутанол,изобутанол и глицерин оказывают разное влияние. Максимальный эффект оказывает бутанол, причем при времени реакции 10 с включение составляет 28,2(контроль 12,4 ) 30 с - 57,1(33,5 ), 60 с - 72,0(52,0 ), 2 мин - 81,5(62,6 ). Внесение спирта заметно увеличивает включение изотопа, возможно, благодаря уменьшению летучести иода за счет увеличения абсорбции его реакционной средой. Заявляемый способ поясняется примером конкретного получения 125-меченного белка, который не ограничивает объем изобретения. В коническую пробирку Эппендорфа вносят 20 мкл 0,1 М натрий фосфатного буфера(НФБ), рН 7,5, 10 мкл (74 МБк) 125, 20 мкл (30 мкг) хорионического гонадотропина,15 мкл изопропанола. Реакцию инициируют внесением 10 мкл (2 мкг) свежеприготовленного раствора хлорамина Т в 0,1 М НФБ, перемешивают 60 с на встряхивателе пробирок(1292, , Швеция). Реакцию останавливают прибавлением 50 мкл (2 мкг) метионина в 0,05 М НФБ. Разбавляют реакционную смесь 150 мкл 0,05 М НФБ, наносят на колонку с сефадексом -100 (140 см), уравновешенную 0,05 М НФБ, содержащим 0,1 бычьего сывороточного альбумина, 0,15 Ми 0,023. Элюирование проводят этим же буфером со скоростью 6 мл/ч. Фракции по 0,5 мл собирают на коллекторе фракций 2112. Из фракций отбирают аликвоты по 10 мкл и просчитывают их активность на гамма-счетчике - 1274 фирмы . Методом осаждения водным раствором 20 -ной трихлоруксусной кислоты определяют фракции, содержащие 125-ХГ. Выход меченого продукта составил 68,1 . Без изопропанола, в этих же условиях, включение равно 52,0 . Иммунореактивность 125-ХГ составляет 93-98 . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4