Способ получения инсулина

61 38/28, 07 14/625 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(73) Патентообладатель Акционерное общество БЕЛМЕДПРЕПАРАТЫ(57) Способ получения инсулина путем экстракции измельченной поджелудочной железы водным этанолом,подкисленным ортофосфорной кислотой, отделения примесных белков в присутствии 2, вакуумдистилляции экстрактов, отделения липидов от экстрактов, сорбции инсулина из экстрактов на катионите КУ-23 И,градиентной десорбции инсулина, кристаллизации из элюата натриевой соли инсулина, цинковой кристаллизации инсулина в цитратном буферном растворе, отделения и сушки кристаллов инсулина, отличающийся тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 , затем 66-70 водноэтанольным раствором, примесные белки отделяют сепарированием при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 водного раствора 2 в количестве 6 мл на 1 л экстракта, сорбцию на катионите проводят в неподвижном слое, градиентную десорбцию инсулина проводят буферными растворами в следующей последовательности 0,2-0,3 М СН 3 СООН 4 ( 5,0-5,5), 0,05-0,1 СН 3 СООН 4 ( 5,8-6,3), 0,1-0,2 М Н 4 НСО 3 (рН 8,2-8,6).(56) Донецкий И.А. Исследование процесса выделения биопрепаратов из поджелудочной железы животных и разработка промышленной технологи Дис.док. хим. наук. - М., 1991. - С. 8-14.332832, 1972.552972, 1977. Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения инсулина. Известен способ получения инсулина путем водно-спиртовой экстракции измельченной поджелудочной железы 82 , затем 65 подкисленным спиртом, двухстадийного осаждения балластных веществ СаС 2(15 мл 20 раствора СаС 2 на 1 л экстракта) при 3,3-3,5 и 4,3-5,3 и последующими сорбцией инсулина из экстракта на катионите СДВ-ЗТ, десорбцией и получением кристаллов инсулина известными методами. Выход 3100 ЕД/кг, активность 25,5 ЕД/мг 2. Недостатками способа являются - неполная экстракция инсулина из-за малого содержания спирта, потери инсулина на стадиях экстракции при указанной температуре, двухстадийного осаждения балластных веществ при 3,3-3,5 и 4,3-5,3, а также из-за высокого содержания СаС 2, и в результате проведения указанным образом процесса десорбции - низкое качество получаемой субстанции, т.е. большое количество примесей, обладающих антигенными свойствами, в частности, проинсулина. Полученный таким образом инсулин не соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г. Известен способ получения инсулина путем водно-спиртовой экстракции поджелудочной железы, трехстадийной депротеинизации инсулинсодержащих экстрактов при 3,5-3,8,4,7-5,1 и 3,7-3,9 с охлаждением, сорбции обезбелоченного экстракта на сульфокатионите КУ-23 30/100 М с последующими про 4685 1 мывками 70 спиртом и 0,2 М уксусно-аммонийным буферным раствором с 5,1, десорбции 0,2 М 4 С-аммонийным буферным раствором с 9,5-9,7 и получения кристаллов инсулина известными методами. Выход 3500-4500 ЕД/кг, активность 24,0-26,5 ЕД/мг 3. Недостатками способа являются потери инсулина в процессе трехстадийного осаждения балластных примесей при 3,5-3,8,4,7-5,1 и 3,7-3,9, а также потери инсулина из-за высокого содержания СаС 2,и в результате проведения заявленным способом процесса десорбции - низкое качество получаемой субстанции, т.е. большое количество примесей, обладающих антигенными свойствами, в частности, проинсулина. Полученный таким образом инсулин не соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г. Прототипом является способ получения инсулина, включающий следующие стадии экстракцию инсулина из измельченной поджелудочной железы, проводимую при объемном содержании этанола в экстракте 65 , отделение примесных белков путем добавления СаС 12 при 3,8-4,0 и 4,7-5,1, вакуумдистилляцию экстрактов до содержания этанола 18-20 , отделение липидов от экстракта, сорбцию инсулина на ионите КУ-23 И в режиме псевдоожижения смолы, градиентную десорбцию инсулина из ионита КУ-23 И, кристаллизацию из элюата натриевой соли инсулина 2,5 Мпри 8,0-8,5, отделение натриевой соли инсулина,перекристаллизацию натриевой соли инсулина 0,5 Мпри 8,5, отделение натриевой соли инсулина и растворение ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографию натриевой соли инсулина на ионите КУ-23 И в 4- форме в градиенте 6,98,59,9, осаждение аморфного цинк-инсулина при 6,0-6,2, кристаллизацию цинковой соли инсулина в цитратном буферном растворе, отделение и сушку кристаллов инсулина. Выход 2650-2700 ЕД/кг, активность 25,5-27,0 ЕД/мг. Полученный инсулин соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г. 1. Недостатками способа являются - неполная экстракция инсулина при объемном содержании этанола в экстракте 65 , потери инсулина при отделении примесных белков СаС 12 в две стадии при 3,8-4,0 и 4,7-5,1, потери инсулина при сорбции из экстрактов в режиме псевдоожижения смолы, наличие стадий перекристаллизации натриевой соли инсулина 0,5 Мпри рН 8,5, отделения натриевой соли инсулина и растворения ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографии натриевой соли инсулина на ионите КУ-23 И в 4-форме в градиенте рН 6,98,59,9, осаждения аморфного цинк-инсулина при рН 6,0-6,2. Задачей изобретения является повышение выхода инсулина, соответствующего требованиям Британской фармакопеи 1988 г., предназначенного для получения хроматографическими методами высокоочищенного инсулина МК. Это достигается тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 , затем 6670 водно-этанольным раствором, подкисленным ортофосфорной кислотой, примесные белки отделяют сепарированием при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 водного раствора СаС 2 в количестве 6 мл на 1 л экстракта, сорбцию проводят на катионите в неподвижном слое, градиентную десорбцию инсулина проводят буферными растворами в следующей последовательности 0,2-0,3 М СН 3 СОО 4 (рН 5,0-5,5), 0,05-0,1 М СН 3 СОО 4 (рН 5,8-6,3), 0,1-0,2 М 43 (рН 8,2-8,6). Изобретение отличается от прототипа тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 , затем 66-70 водно-этанольным раствором, подкисленным ортофосфорной кислотой, примесные белки отделяют при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 водного раствора 2 в количестве 6 мл на 1 л экстракта, сорбцию на катионите проводят в неподвижном слое, градиентную десорбцию инсулина проводят буферными растворами в следующей последовательности 0,2-0,3 М СН 3 СОО 4 (рН 5,0-5,5), 0,05-0,1 М СН 3 СОО 4 (рН 5,8-6,3), 0,1-0,2 М 43 (рН 8,2-8,6) и благодаря этим отличительным признакам при получении инсулина заявленного в прототипе качества отпадает необходимость в следующих стадиях перекристаллизации натриевой соли инсулина 0,5 Мпри 8,5, отделения натриевой соли инсулина и растворения ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографии натриевой соли инсулина на ионите КУ-23 И в 4-форме в градиенте 6,98,59,9, осаждения аморфного цинк-инсулина при 6,0-6,2. Способ поясняется примером. Пример. 450 кг измельченной поджелудочной железы заливают 1750 л 83 -ного водно-этанольного раствора,подкисленного ортофосфорной кислотой (уд. вес 1,67) до 3,0 и экстрагируют при перемешивании и температуре 15 С в течение 3 ч. Экстракт отделяют центрифугированием, а осадок повторно заливают 750 л 70 водно-этанольного раствора, подкисленного ортофосфорной кислотой до 3,0, и экстрагируют при перемешивании и температуре 15 С в течение 1,5 ч. В экстракт добавляют 20 водный раствор СаС 2 в количестве 6 мл на 1 л и доводятдо 4,4. Примесные белки отделяют сепарированием. Прозрачный экстракт подкисляют 20 раствором серной кислоты до 3,8 и отстаивают в течении 2 ч. Прозрачный раствор отделяют сифонированием и осадок отфильтровывают. Полученный раствор подвергают вакуумвыпарке до содержания спирта в концентрате 15 . Водно-спиртовой концентрат обезжиривают и фильтруют. Инсулин из полученного раствора сорбируют на колонку 120 см,30 см, упакованную макропористым сульфо 2 4685 1 катионитом КУ-23 И, со скоростью 70 л/ч. На колонну сорбируют экстракты от 4500 кг поджелудочной железы. Градиентную десорбцию инсулина проводят со скоростью подачи элюента 70 л/ч в следующей последовательности 550 л 65 водно-этанольного раствора, 250 л 0,3 М СН 3 СОО 4 ( 5,3), 500 л 0,1 М СН 3 СОО 4 ( 6,0), 250 л 0,1 М 4 НСО 3 ( 8,5). Фракцию инсулина собирают, начиная с концентрации белка в элюате 0,5 мг/мл, до 4 мг/мл после прохождения максимума пика элюции. Из полученного элюата 2,5 при 8,5 получают натриевую соль инсулина, а затем проводят цинковую кристаллизацию инсулина в цитратном буферном растворе. В итоге получают 547 г кристаллического инсулина с активностью 25,5 ЕД/мг и выходом 3100 ЕД/кг сырья, соответствующего требованиям Британской фармакопеи 1988 г. Таким образом, заявленный способ позволяет достигнуть поставленной задачи - повысить выход инсулина, соответствующего требованиям Британской фармакопеи 1988 г., до 2800-3200 ЕД/кг сырья с активностью 25,5-27,0 ЕД/мг против 2650-2700 ЕД/кг сырья, как указано в прототипе. Источники информации 1. Донецкий И.А. Исследование процесса выделения биопрепаратов из поджелудочной железы животных и разработка промышленной технологии Дис.док. хим. наук. - М., 1991. - С. 8-14 (прототип). 2.332832, 1972. 3.552972, 1977. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.