Биоаффинный сорбент для избирательного выделения аутоиммунных антител к ДНК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БИОАФФИННЫЙ СОРБЕНТ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ К ДНК(73) Патентообладатели Голубович Владимир Петрович, Кирковский Валерий Васильевич,Гапанович Владимир Николаевич, Ландо Дмитрий Юрьевич,Мартинович Вера Павловна,Дусь Дмитрий Дмитриевич,Поликарпова Валентина Ивановна,Митьковская Наталья Павловна, Егорова Валентина Петровна, Досин Юрий Михайлович(57) Биоаффинный сорбент для избирательного выделения аутоиммунных антител к ДНК общей формулы, где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами связывания азотистых оснований. Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины, а именно к новому полимерному ДНК-содержащему сорбенту, биоспецифичному относительно аутоиммунных антител к ДНК. Данный сорбент может использоваться для удаления антител из плазмы крови больных системной красной волчанкой(СКВ). Эти антитела, относящиеся к белкам иммуноглобулиновых фракций, вносят существенный вклад в реализацию клинических проявлений СКВ, имеют высокую патогенетическую значимость. Современным методом регуляции содержания различных компонентов крови, связанных с патологическими состояниями, является использование гемоспецифичных сорбентов. Известен сорбент для избирательного удаления сериновых протеиназ 1, биоспецифичным лигандом которого служит овомукоид куриных яиц, а полимерной основой - полиакриламидный гель. Однако данный сорбент не является биоспецифичным относительно аутоиммунных антител к ДНК. Известны биоаффинные сорбенты с использованием ДНК в качестве аффинного лиганда и целлюлозы - в качестве матрицы-носителя 2,3. Однако такие сорбенты находят применение только в лабораторной практике для выделения аутоантител для научных исследований, так как использование сорбентов для непосредственного контакта с плазмой крови в процессе лечения больных предполагает ряд требований к сорбенту. В данном случае необходимо использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих примесей,могущих вызвать нежелательные побочные эффекты, и инертного, стабильного полимера-носителя. Задачей изобретения является получение нового сорбента для избирательной сорбции из плазмы крови больных системной красной волчанкой аутоиммунных антел к ДНК, биоспецифичным лигандом которого является ДНК, а полимером-матрицей - полиакриламидный гель. Задача решается заявляемым сорбентом формулы, где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами связывания азотистых оснований. Для получения сорбента используют препарат ДНК массой более 20 млн. дальтон, полученный из селезенки крупного рогатого скота, характеризующийся высокой степенью чистоты. Содержание белковых примесей, определяемых с использованием высокочувствительного метода 4, составляет менее 0,1 . Выбор полиакриламидной полимерной матрицы обусловлен в первую очередь ее стабильностью, инертностью,доступностью, хорошей совместимостью именно с высокомолекулярными лигандами. Для ковалентной иммобилизации ДНК проводят ацилирование ее акрилоилхлоридом, которое происходит при взаимодействии реагента с аминогруппами пуриновых и пиримидиновых оснований, отличающихся высокой нуклеофильностью. Далее ацилированную ДНК использовали как мономер при сополимеризации акриламида, ,-метиленбисакриламида в присутствии персульфата аммония и тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации. Пример 1. Получение биоаффинного сорбента. К 60 мл 2 раствора бикарбоната натрия прибавляют 40 мл раствора, содержащего 1,0 мг/мл ДНК, затем прибавляют 0,02 мл акрилоилхлорида, раствор перемешивают в течение 20 мин. Затем в реакционный сосуд 2 3934 1 вносят 4,5 г акриламида, 0,5 г метиленбисакриламида, после полного их растворения прибавляют 0,3 г персульфата аммония и 0,2 мл тетраметилендиамина. Все компоненты перемешивают и оставляют для полимеризации, которая происходит спустя 1-2 мин. Гель оставляют на 20 мин, затем измельчают с использованием шприца с диаметром выходного отверстия 3 мм, гранулы промывают многократно дистиллированной водой(общий объем промывных вод 4 л). Содержание ДНК в набухшем сорбенте составляет 0,10-0,15 мг/мл. Отмытый гель хранили в 0,9 растворе хлористого натрия в холодильнике. Пример 2. Изучение сорбции аутоиммунных антител. Изучение сорбционных характеристик ДНК-содержащего сорбента проводят в серии стендовых экспериментов по определению динамики уровня антител к ауто-ДНК в сыворотке крови больных СКВ до и после иммуносорбции. Сыворотка была получена в результате плазмофереза 22 больным СКВ, затем была заморожена при -18 С. После ее размораживания определяют исходный уровень антител к ауто-ДНК по методу Ф. Затем проводят перфузию сыворотки через массообменник с ДНК-содержащим сорбентом в режиме рециркуляции. По окончании сорбции вновь определяют уровень антител. Параметры сорбции. Объем сыворотки - 802,3 мл, скорость перфузии сыворотки через массообменник - 6 мл в минуту, режим перфузии - рециркуляция. Общее количество перфузируемой через массообменник сыворотки составило 40011,5 мл (пятикратная перфузия данной сыворотки через массообменник). Масса сорбента - 10,00,6 г. Исходный уровень антител к ауто-ДНК составлял в среднем 17,02,2 ед. (норма - 12,5 ед.). В процессе иммуносорбции уровень антител уменьшился до 11,21,4 ед. Таким образом, перфузия сыворотки больных СКВ через исследуемый ДНК-содержащий иммуносорбент приводит к достоверному снижению уровня антител к ауто-ДНК. Источники информации 1. А. с. СССР 1137388, МПК 01 33/50. 2..,Х.,.,.-// .. - 1995. - . 23. -12. . 2344-2345. 3. Леках И.В., Поверенный А.М. Антитела к ДНК в препаратах иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых людей находятся в свободном и связанном состояниях // Мол. биол. - 1996. - Т.30. - ып. 3. - С. 707-713. 4. Ландо Д.Ю., Егорова В.П., Крот В.И., Ахрем А.А. Определение содержания белковых примесей в препаратах ДНК выской чистоты // Мол. биол. - 1996. - Т. 30. - Вып. 3. - С. 701-706. 5.,,.,// . - 1968. - . 161. - .806-808. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3