Биоселективный сорбент и способ избирательного удаления из крови человека антител к резус-фактору

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОСЕЛЕКТИВНЫЙ СОРБЕНТ И СПОСОБ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА АНТИТЕЛ К РЕЗУС-ФАКТОРУ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Макаревич Денис Александрович Федоров Александр Александрович Козлякова Ольга Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) ВАЛУЕВА Т.А. и др. Синтетические полимеры медицинского назначения. Тезисы докладовВсесоюзного симпозиума. - Минск, 1985. - С. 14.2360707 1, 2009.1748830 1, 1992.1777893 1, 1992.1708400 1, 1992.1479511 1, 1989.2325172 2, 2008. ШАБЛОВСКИЙ В.О. и др. Вестник БГУ. - Сер. 2. - 2009. -3. - С. 10-15.(57) 1. Биоселективный сорбент для избирательного удаления из крови человека антител к резус-фактору общей формулы где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации лигандов,представляющих собой тени резус-положительных эритроцитов, которое имеет значение от 1 до 70,- число участков цепи с лигандом, имеющее интервал значений 50-10000. 2. Способ избирательного удаления антител к резус-фактору, при котором проводят гемосорбцию с использованием биоселективного сорбента по п. 1. Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть использовано для избирательного удаления из крови человека антител к резус-фактору, в том числе из крови сенсибилизированных женщин. 17828 1 2013.12.30 Резус-конфликт - иммунологическая несовместимость крови матери и плода по резусфактору, в результате чего в организме матери синтезируются антитела к резус-фактору. Резус-антитела вступают в реакцию с резус-положительными эритроцитами плода, что ведет к их гемолизу 1. Известен способ удаления антител к резус-фактору из плазмы крови, который заключается в проведении процедуры плазмафереза. Однако клинический эффект такой процедуры является непродолжительным (от нескольких дней до 2-3 месяцев), а снижение антител к резус-фактору - неполным. Метод плазмафереза обладает следующими недостатками неселективностью - удаляются все компоненты плазмы ослабление иммунного статуса пациентов из-за сопутствующего удаления антител, не являющихся цитотоксическими в отношении проводимой терапии тяжело переносится пациентами и имеется риск осложнений требует использования плазмозамещающих растворов 2. Задача изобретения - получение нового биоселективного сорбента для избирательной сорбции антител к резус-фактору из крови человека с помощью метода гемосорбции. Ранее метод гемосорбции для удаления антител к резус-фактору не применялся. Для решения данной задачи в качестве полимера-матрицы используют полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда - тени резус-положительных эритроцитов. Сорбент имеет следующую химическую формулу 2 где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации лигандов,которое имеет значение от единицы до 70,- число участков цепи с лигандом, имеющее интервал значений 50-10000. Заявляемый афинный сорбент аналогов не имеет. Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения вводимого лиганда в мономер проводят частичное ацилирование акрилоилхлоридом аминокислот, входящих в состав белков мембраны эритроцитов. Полученное производное используют как мономер при сополимеризации акриламида, ,-метиленбисакриламида в присутствии персульфата аммония и -тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации 3. Получение заявляемого сорбента приведено в примере 1. Пример 1. Тени резус-положительных эритроцитов выделяют в соответствии с методикой Доджа 4. К раствору, содержащему 0,033 г выделенных теней резус-положительных эритроцитов, объемом 5 мл 2 -ного раствора бикарбоната натрия по каплям прибавляют 0,008 мл (0,09 ммоль) акрилоилхлорида и перемешивают реакционную смесь в течение 30 мин, затем фильтруют. В реакционный сосуд вносят 0,342 г акриламида и 0,036 г ,-метиленбисакриламида. После растворения компонентов к реакционной смеси прибавляют 0,015 г персульфата аммония и 0,01 мл -тетраметилендиамина. Через 1-3 мин образуется прозрачный гель. Гель оставляют на 30 мин, затем измельчают с использованием шприца с диаметром выходного отверстия 2 мм. Опалесцирующие гранулы многократно промывают дистиллированной водой (общий объем 0,5 л), а затем 0,9 -ным раствором(общий объем 0,3 л). 2 17828 1 2013.12.30 Концентрация лиганда в набухшем геле составляет 1-2 мг/мл. Отмытый гель хранят в 0,9 -ном растворев холодильнике. Заявляемый сорбент может быть использован для селективного удаления антител к резус-фактору из крови человека. Метод удаления антител с помощью заявляемого сорбента приведен в примере 2. Сорбционная избирательность заявляемого сорбента подтверждается сорбционными характеристиками, приведенными в примере 3. Пример 2. Стендовые исследования по оценке сорбционной возможности заявляемого сорбента проводят с использованием методики плазмасорбции 5. Используют плазму крови беременных женщин с диагнозом резус-конфликт с высоким титром антирезусных антител. Гель, содержащий в качестве лиганда тени резус-положительных эритроцитов (10 мл),промывают физиологическим раствором(0,9 ) (общий объем 100 мл). Гель помещают в массообменную колонку объемом 20 мл. Для создания замкнутого контура используют универсальную систему для гемотрансфузий. Систему подключают к перистальтическому насосу и пропускают плазму резус-сенсибилизированного пациента через колонку с сорбентом. Пробы для проведения непрямой реакции Кумбса отбирают до начала эксперимента и после 20,40,60 мин эксперимента в количестве 1 мл. Для сравнения полученных результатов проводят стендовый эксперимент на образце сорбента без лиганда. Для определения титра антител к резус-фактору применяют методику проведения непрямой пробы Кумбса 6. Пример 3. Для определения титра антител к резус-фактору в пробах плазмы крови используют стандартные, отмытые резус-положительные эритроциты первой группы от семи доноров сыворотку Кумбса. Одну каплю исследуемой сыворотки и четыре капли эритроцитов инкубируют в течении 45 мин. Затем титруют и добавляют две капли сыворотки Кумбса. Реакцию агглютинации оценивают в течение 5 мин. Результаты исследований показали, что на полиакриламидной матрице, содержащей в качестве лиганда тени резус-положительных эритроцитов, адсорбировалось 70 антител к резус-фактору, что свидетельствует о высокой сорбционной способности заявляемого сорбента по отношению к антителам к резус-фактору. Источники информации 1. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунология беременности. - М. РАМН, 2003. - 400 с. 2. Конопляников А.Г. Гемолитическая болезнь плода при резус-сенсибилизации современные аспекты диагностики, лечения и профилактики // Акуш. и гин. - 2005. -6.С.63-68. 3. Талако Т.М., Макаревич Д.А., Рябов А.А., Ровдо И.М., Кирковский В.В., Голубович В.П Биоспецифическая сорбция новые направления в комплексной терапии заболеваний. Актуальные вопросы экстракорпоральной терапии. Мат. научно-пр.конф. - М., 2007. - С. 72. 4. // . . . - 1963. - . 100. - . 1. - . 119-130. 5. Глокнер В.М., Саклер Е. Плазмосорбция через иммобилизированный конканавалин А и протеин А // 7-й Международный симпозиум по гемосорбции. - 1985. -4. - С. 3-7. 6. Луговская С.А. и др. Лабораторная гематология. - М., 2002. - С. 116-125. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3