Способ выявления неполных антиэритроцитарных антител в сыворотке крови

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕПОЛНЫХ АНТИЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гематологии и трансфузиологии(72) Авторы Левин Валерий Ильич Луц Людмила Станиславовна Чумакова Елена Дмитриевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии(56) Иммуногематология. - М., 1959. - С. 346353. ЛЕВИН В.И. и др.съезд гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь. Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии Сб. научн. тр. к 70-летию НИИ гематологии и переливания крови. Т. 2. - Минск, 2003. С. 78-81.(57) Способ выявления неполных антиэритроцитарных антител в сыворотке крови, отличающийся тем, что смешивают тест-эритроциты с исследуемой сывороткой крови в объемном соотношении 13, инкубируют в течение 45 минут при 42-45 С, промывают физиологическим раствором, делят на две порции и в течение 10 минут инкубируют одну порцию эритроцитов в антиглобулиновой сыворотке, а вторую порцию - в физиологическом растворе, после чего эритроциты отмывают физиологическим раствором и определяют их электрофоретическую подвижность в фосфатном буфере с рН 7,4, смешанном с 6 -ным раствором глюкозы в соотношении 13, при этом наличие неполных антител в исследуемой сыворотке крови констатируют, если величина электрофоретической подвижности эритроцитов, инкубированных с антиглобулиновой сывороткой, меньше величины электрофоретической подвижности эритроцитов, инкубированных с физиологическим раствором. Изобретение относится к области медицины и касается способов выявления неполных антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Известен способ исследования сыворотки крови на наличие неполных антител с применением желатина, включающий получение сыворотки крови, инкубацию тестэритроцитов в исследуемой сыворотке с добавлением 10 раствора желатина в водяной бане, последующее добавление в исследуемые образцы семикратного объема физиологического раствора хлористого натрия и учет результата в виде наличия или отсутствия агглютинатов 1. Известный способ характеризуется недостаточной разрешающей способностью 2. 12718 1 2009.12.30 Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выявления неполных антиэритроцитарных антител в непрямой пробе Кумбса, включающий получение сыворотки крови, инкубацию отмытых тест-эритроцитов в исследуемой сыворотке, их отмывку, смешивание отмытых эритроцитов с антиглобулиновой сывороткой (АГС) и оценку результатов реакции по наступлению агглютинации эритроцитов 3. К недостаткам известного способа относится недостаточная чувствительность способа, обусловленная порогом выявления с его помощью количества белковых молекул, фиксированных на поверхности тест-клеток. По данным литературы, он не должен быть менее 500 молекул иммуноглобулинана эритроците 4. Отмечается существенная зависимость получаемых результатов от качества используемых антиглобулиновых сывороток. Последние с низким титром специфических антител к белкам крови могут давать ложноотрицательные результаты реакции. Вместе с тем от порядка 30-40 животных (кроликов), иммунизируемых для приготовления АГС, получаются сыворотки, непригодные для проведения проб Кумбса. Задача настоящего изобретения - повышение чувствительности способа. Технический результат - возможность выявления неполных антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Поставленная задача достигается тем, что смешивают тест-эритроциты с исследуемой сывороткой крови в объемном соотношении 13, инкубируют в течение 45 минут при 4245 С, промывают физиологическим раствором, делят на две порции и в течение 10 минут инкубируют одну порцию эритроцитов в антиглобулиновой сыворотке, а вторую порцию в физиологическом растворе, после чего эритроциты отмывают физиологическим раствором и определяют их электрофоретическую подвижность в фосфатном буфере с рН 7,4,смешанном с 6 -ным раствором глюкозы в соотношении 13, при этом наличие неполных антител в исследуемой сыворотке крови констатируют, если величина электрофоретической подвижности эритроцитов, инкубированных с антиглобулиновой сывороткой,меньше величины электрофоретической подвижности эритроцитов, инкубированных с физиологическим раствором. Меньшая величина электрофоретической подвижности (ЭФП) эритроцитов, обработанных АГС, по сравнению с ее значением для клеток, проинкубированных в физиологическом растворе, свидетельствует о специфической сорбции антител на поверхности тестэритроцитов и, следовательно, об их наличии в исследуемой сыворотке. В основу заявляемого способа выявления неполных антиэритроцитарных антител положен подход изучения сорбции белковых молекул на мембране эритроцитов путем определения величины их ЭФП. Ее снижение после обязательной отмывки тест-клеток свидетельствует о специфической сенсибилизации тест-клеток антителами за счет реакции антиген-антитело. Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Из периферической крови здорового человека выделяют тест-эритроциты, на которых экспрессированы антигены, специфичные относительно антител, предположительно содержащихся в исследуемой сыворотке крови (например, при поиске антирезус антител анти , С, Е на эритроцитах должны быть представлены антигены , С, Е системы Резус). Эритроциты трижды отмываются 0,9 раствором хлористого натрия. К одному объему тест-эритроцитов добавляются три объема исследуемой сыворотки крови, и взвесь инкубируется в термостате при 42-45 С в течение 45 минут. Затем проинкубированные эритроциты трижды отмываются физиологическим раствором хлористого натрия и разделяются на две равные порции. Одна порция ресуспендируется в трехкратном объеме АТС, вторая - в таком же объеме физиологического раствора хлористого натрия и далее инкубируются в течение 10 минут при комнатной температуре. После трехкратной отмывки физиологическим раствором хлористого натрия определяется ЭФП эритроцитов 2 12718 1 2009.12.30 обеих порций на любом используемом для этих целей приборе, например на цитоферометре фирмы Оптон или микрокамере Абрамсона в модификации С.С. Харамоненко. В качестве катафоретической среды (среды измерения) используется фосфатный буфер рН 7,4 в смеси с 6 раствором глюкозы в соотношении 13. Величину ЭФП рассчитывают по формуле/, где- расстояние, на которое передвинулись исследуемые эритроциты,- время в секундах, в течение которого они проходят это расстояние, Н - величина градиента потенциала. Для каждого образца определяется ЭФП не менее 15 клеток и высчитывается их среднее значение. После сопоставления величин ЭФП образца, обработанного АТС, и образца,обработанного физиологическим раствором хлористого натрия, делается вывод о наличии неполных неагглютинирующих антиэритроцитарных антител в сыворотке крови. Об их присутствии свидетельствует меньшая величина ЭФП тест-клеток, обработанных антиглобулиновой сывороткой. Теоретическим обоснованием разработанного способа определения неполных антиэритроцитарных антител является известное явление изменения ЭФП эритроцитов при сорбции на их поверхности белковых молекул. Однако их экспрессия на мембране клеток выявляется только при сенсибилизации эритроцитов определенным минимумом антител. Именно этим обстоятельством объясняются отрицательные результаты пробы Кумбса,наиболее широко используемой для выявления неполных антител. В заявляемом способе в результате обработки эритроцитов антиглобулиновой сывороткой, в случае присутствия на их поверхности неполных антител в дозах ниже порога чувствительности пробы Кумбса, образуются дополнительные специфические комплексы антиген-антитело, в которых в качестве антигена выступают антиэритроцитарные антитела, сорбированные на эритроцитах, а в качестве антител - антитела, содержащиеся в антиглобулиновой сыворотке. В результате выполнения заявляемого способа количество белковых молекул, сорбированных на эритроцитах, увеличивается, что приводит к изменению ЭФП эритроцитов, регистрируемой методом аналитического микроэлектрофореза клеток. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Из крови резус-отрицательного донора А., проиммунизированного резус-положительными эритроцитами, получена сыворотка крови с титром антирезус (анти-) антител 132, установленным в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка крови разведена 0,9 раствором хлористого натрия в соотношении 1 мл сыворотки плюс 63 мл физиологического раствора хлористого натрия. С использованием -положительных эритроцитов 0 группы разведенная сыворотка исследовалась на наличие неполных анти- антител по прототипу (в непрямой пробе Кумбса) и заявляемым способом. Результаты непрямой пробы Кумбса свидетельствовали об отсутствии анти- антител в исследуемом образце, т.е. были отрицательными. Исходный (неразведенный) образец содержал антитела в титре 132, и, следовательно, они, бесспорно, присутствовали в разведенном до субагглютинационной дозы образце, но при этом их концентрация была ниже порога чувствительности классической непрямой пробы Кумбса. Выявление антиантител заявляемым способом включало обработку -положительных эритроцитов исследуемой сывороткой в объемном соотношении 13, их инкубацию в термостате при 42 С в течение 45 минут, последующую трехкратную отмывку с разделением отмытых эритроцитов на две порции. Одну порцию клеток инкубировали в антиглобулиновой сыворотке в соотношении 11, вторую - в тех же соотношениях в физиологическом растворе. Затем определялась ЭФП трехкратно отмытых эритроцитов обеих порций. ЭФП тест-эритроцитов,проинкубированных в антиглобулиновой сыворотке, равнялась 1,07 мкм с-1 В-1 см (при64 мкм,4,21 с, Н 14,2 В/см), а в физиологическом растворе 1,14 мкм с-1 В-1 см(при 64 мкм,3,96 с, Н 14,2 В/см). Более низкая величина ЭФП образца эритроци 3 12718 1 2009.12.30 тов, инкубированных в антиглобулиновой сыворотке, свидетельствует о присутствии антирезус антител в исследуемом образце разведенной сыворотки крови. Следовательно, разработанный способ выявления неполных антител обладает большей чувствительностью по сравнению с непрямой пробой Кумбса. Пример 2. Донор Ж. -отрицательный, иммунизировался -положительными эритроцитами для получения сыворотки крови, содержащей анти- антитела. После трехкратного введения-положительных эритроцитов венепункцией у донора получали кровь, из которой готовилась сыворотка. Контроль на наличие анти- антител в сыворотке крови проводили с использованием -положительных эритроцитов в непрямой пробе Кумбса. Результаты анализа отрицательные, т.е. на момент обследования анти- антитела в непрямой пробе Кумбса не выявлялись. Одновременно проводилась идентификация анти- антител заявляемым способом проинкубированные в исследуемой на наличие анти- антител сыворотке эритроциты после отмывки разделяли на две порции. Первую порцию инкубировали в антиглобулиновой сыворотке, вторую в физиологическом растворе хлористого натрия,определяли ЭФП эритроцитов в каждой порции. ЭФП эритроцитов первой порции составила 1,08 мкм с-1 В-1 см, второй - 1,17 мкм с-1 В-1 см. Более низкая величина ЭФП эритроцитов, обработанных антиглобулиновой сывороткой, по сравнению с величиной ЭФП эритроцитов, обработанных физиологическим раствором, указывает на присутствие в исследуемой сыворотке крови анти- антител. Действительно, в пробе крови, взятой через 10 дней после первого исследования, они начали выявляться и в непрямой пробе Кумбса. Таким образом, заявляемый способ выявления неполных антиэритроцитарных антител является более чувствительным по сравнению с известным способом (непрямой пробой Кумбса), наиболее широко применяемым в клинико-лабораторной практике. Поставленная цель была достигнута путем создания дополнительного иммунного комплекса антитело-антитело, включавшего антитела, специфически сорбированные на эритроцитах за счет сродства к экспрессированным на их поверхности эритроцитарным антигенам и антител антиглобулиновой сыворотки, направленных к этим антителам. Данным способом в 5 опытах определено наличие неполных антиэритроцитарных антител в сыворотках крови резус-отрицательных доноров, проиммунизированных резусположительными эритроцитами для получения антирезус сывороток. В первой серии использовались антирезус сыворотки с титром антител 132-164, определенных непрямой пробой Кумбса с использованием АГС фирмы Санофи. Исследуемые сыворотки разводились физиологическим раствором хлористого натрия до достижения содержания в них антител субагглютинационных концентраций, т.е. концентраций, не выявляемых непрямой пробой Кумбса (например, при титре антирезус антител 164 - в 128 раз 1 мл сыворотки плюс 127 мл физиологического раствора). О достаточности разведения судят на основании отрицательного результата непрямой пробы Кумбса. Затем присутствие антител в разведенных сыворотках определяют заявляемым способом. Полученные данные представлены в табл. 1. Из представленных данных видно, что во всех исследованных случаях антирезус антитела в разведенных сыворотках в непрямой пробе Кумбса не выявлялись. Напротив,разработанным способом они идентифицировались в 100 случаев, о чем свидетельствовала более низкая величина ЭФП эритроцитов, обработанных АГС, по сравнению с ЭФП красных кровяных клеток, обработанных физиологическим раствором хлористого натрия. 12718 1 2009.12.30 Таблица 1 Влияние антиглобулиновой сыворотки на ЭФП эритроцитов, сенсибилизированных субагглютинационными дозами неполных анти- антител ЭФП эритроцитов, обработанных субагглютинационными дозами анти- сыворотки в мкм с-1 В-1 см Сыворотка Эритроциты, обработан- Эритроциты, обработанкрови доноров ные физиологическим ные антиглобулиновойизменения ЭФП раствором сывороткой А. 1,14 1,07 6,1 Б. 1,15 1,09 5,2 В. 1,19 1,13 5,0 Г. 1,22 1,15 5,7 Д. 1,19 1,14 4,7 М 1,1780,014 1,1160,015 5,240,32 Примечание проба Кумбса во всех случаях отрицательная.- достоверность различий при уровне значимости р 0,05 по отношению к эритроцитам, обработанным физиологическим раствором. Во второй серии опытов в качестве контролируемых использовались сыворотки крови доноров в процессе иммунизации (иммунный процесс в ходу) 5, т.е. когда известными методами, в том числе и в непрямой пробе Кумбса, антирезус антитела еще не выявлялись. Результаты этой серии опытов представлены в табл. 2. И в этой серии экспериментов, как видно из таблицы, заявляемым способом во всех случаях выявлялись антирезус антитела в период, когда результаты непрямой пробы Кумбса были отрицательны. Дальнейшее обследование иммунизируемых доноров в более отдаленные от начала иммунизации сроки с использованием непрямой пробы Кумбса подтвердило наличие в их сыворотке крови неполных антирезус антител. Таблица 2 Влияние антиглобулиновой сыворотки на ЭФП эритроцитов, обработанных сывороткой крови резус-отрицательных доноров, иммунизируемых -антигеном ЭФП эритроцитов, обработанных сывороткой крови резус-отрицательных доноров, иммунизируемых -антигеном, мкм с-1 В-1 см Сыворотка Эритроциты, обработан- Эритроциты, обработанкрови доноров ные физиологическим ные антиглобулиновойизменения ЭФП раствором сывороткой Е. 1,17 1,10 5,9 Ж. 1,17 1,08 7,6 3. 1,23 1,17 4,8 И. 1,21 1,12 7,4 К. 1,19 1,10 7,5 М 1,1940,01 1,110,01 6,60,55 Примечание проба Кумбса во всех случаях отрицательная.- достоверность различий при уровне значимости р 0,05 по отношению к эритроцитам, обработанным физиологическим раствором. Следовательно, заявляемый способ позволил выявить антитела в более ранние сроки,что говорит о его большей чувствительности по сравнению с общепринятой для этих целей антиглобулиновой пробой. 12718 1 2009.12.30 Источники информации 1. Иммуносерология (нормативные документы) / Составители А.Г. Башлай, С.И. Донсков. - М. ВИНИТИ РАН, 1998. - С. 117-119. 2. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии. - СПб., 2004. С. 103-104. 3. Доссе Ж. Иммуногематология. - М. Медгиз, 1959. - С. 349-353. 4. Рагимов А.А., Байрамалибейли И.Э. Основы диагностики, профилактики и лечения анемий. - М. ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - С. 204, 209. 5. Донсков С.И. Группы крови системы . Теория и практика. - М. ВИНИТИ РАН, 2005. - С. 15. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6