Биоселективный сорбент для избирательного выделения эластаз из различных биологических жидкостей

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОСЕЛЕКТИВНЫЙ СОРБЕНТ ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ЭЛАСТАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Чемитова Лилия Михайловна Поликарпова Валентина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Биоселективный сорбент для избирательного выделения эластаз из различных биологических жидкостей, имеющий общую формулу где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70- число участков цепи с лигандом, имеющее значение 50-10000. 12018 1 2009.06.30 Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть использовано для избирательного выделения эластаз из различных биологических жидкостей, в том числе из плазмы крови больных с различными воспалительными заболеваниями. Протеолитический фермент эластаза вовлечен в развитие многих воспалительных процессов, таких как эмфизема артриты хронический бронхит хронический и острый панкреатиты новообразование (рак) поджелудочной железы и др. 1. Известен сорбент 2, 3, содержащий в качестве лиганда ковалентно пришитый белок овомукоид, обладающий ингибиторной активностью по отношению к ряду протеолитических ферментов. Недостаток данного сорбента заключается в том, что он позволяет выделять из биологической жидкости все присутствующие в ней протеолитические ферменты и не является специфичным по отношению к эластазе. Задачей данного изобретения является получение нового биоселективного сорбента для избирательной сорбции эластаз из различных биологических жидкостей. Для решения данной задачи в качестве полимера-матрицы используют полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда-ингибитора - тетрапептид при следующем соотношении компонентов (мас. ) полиакриламид - от 5 до 10, от 0,1 до 0,4. Сорбент имеет следующую химическую формулу где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70, - число участков цепи с лигандом, имеющее значение 50-10000. Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения вводимого в качестве лиганда пептида в мономер проводят его ацилирование акрилоилхлоридом. Полученное производное используют как мономер при сополимеризации акриламида, ,-метиленбисакриламида в присутствии персульфата аммония и -тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации. Получение заявляемого сорбента приведено в примере 1. 2 12018 1 2009.06.30 Пример 1. К раствору 0,033 г (0,06 ммоль) дигидрохлорида треонил-аргинил-валил-валина в 5 мл 2 раствора бикарбоната натрия по каплям прибавляют 0,008 мл (0,09 ммоль) акрилоилхлорида и перемешивают реакционную смесь в течение 30 мин, затем фильтруют. В реакционный сосуд вносят 0,342 г акриламида и 0,036 г ,-метиленбисакриламида. После растворения компонентов к реакционной смеси прибавляют 0,015 г персульфата аммония и 0,01 мл -тетраметилендиамина. Через 1-3 мин образуется прозрачный гель. Гель оставляют на 30 мин, затем измельчают с использованием шприца с диаметром выходного отверстия 2 мм. Опалесцирующие гранулы сперва многократно промывают дистиллированной водой (общий объем 0,5 л), а затем 0,9 раствором(общий объем 0,3 л). Содержание треонил-аргинил-валил-валина в набухшем геле составляет 1-2 мг/мл. Отмытый гель хранят в 0,9 растворев холодильнике. Сорбционная избирательность заявляемого сорбента подтверждается сорбционными характеристиками, приведенными в примерах 2 и 3. Пример 2. Исследования проводят на приборе. Используют водную суспензию панкреатической эластазы свиньи(США). Гель, содержащий треонил-аргинил-валил-валиновый лиганд (5 мл), промывают буферным раствором Трис- (рН 8,0) (общий объем 5 мл). К набухшему гелю прибавляют 5 мл буферного раствора Трис- (рН 8,0), содержащего 0,4 мл водной суспензии эластазы с концентрацией 210-5 моль/л. Реакционную смесь оставляют на сутки при комнатной температуре. Для определения оптической плотности холостого образца, т.е. до сорбции, в опытную кювету вносят 2,7 мл буферного раствора Трис-НС (рН 8,0), 0,1 мл водной суспензии эластазы (С 210-5 моль/л) и 0,2 мл субстрата (С 110-3 моль/л). В кювету сравнения перед субстратом вносят 0,15 мл ледяной уксусной кислоты. Для определения оптической плотности после сорбции в опытную кювету вносят 2,8 мл раствора после отфильтровывания сорбента и 0,2 мл субстрата (С 110-3 моль/л). Кювета сравнения, как в опыте с холостым образцом. Результаты исследований показали, что на полиакриламидной матрице, содержащей треонил-аргинил-валил-валиновый лиганд, адсорбировалось 80 эластазы, что свидетельствует о высокой сорбционной способности заявляемого сорбента по отношению к протеолитическому ферменту эластазе. Методика выделения адсорбированной эластазы приведена в примере 3. Пример 3. Исследования проводят на приборе. Десорбцию эластазы с полимерной матрицы проводят последовательно с помощью 1) 0,05 М раствора Трис- (рН 3,2, 5-8 мл) 2) 0,1 М раствора Трис- (рН 8,0, 8-10 мл) 3) 1,0 М раствора Трис- (рН 8,0, 8-10 мл). Для определения оптической плотности после десорбции эластазы с полимерного носителя в опытную кювету вносят 2,8 мл промывного раствора, прошедшего через сорбент,и 0,2 мл субстрата (С 110-3 моль/л). В кювету сравнения вносят 2,7 мл буферного раствора Трис- (рН 8,0), 0,1 мл водной суспензии эластазы (С 210-5 моль/л), 0,15 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл субстрата (С 110-3 моль/л). По результатам исследований 40 эластазы десорбировалось с полиакриламидной матрицы, содержащей тетрапептидный лиганд-ингибитор, что свидетельствует о возможности выделения эластазы с помощью заявляемого сорбента. 12018 1 2009.06.30 Источники информации 1... // . . . - 1985. - . 36. - . 207-216. 2. Кирковский, В.В. Детоксикационная терапия при перитоните. - Минск ПолифактАльфа, 1997. - С. 200. 3. Голубович В.П. и др. Биоаффиные сорбенты для применения в эфферентных методах лечения (гемосорбции). Биорегуляторы исследование и применение Сб.науч.тр. ИБОХ НАН Беларуси. - Минск, 2003. - С. 200-209. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4