Способ предтрансплантационного культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРЕДТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Богдан Василий Генрихович Гаин Юрий Михайлович Демидчик Юрий Евгеньевич Зафранская Марина Михайловна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(56). 2009. - . 76. - . 2. - . 56-66. СЕРГЕЕВА Н.С. и др. Молекулярная медицина. - 2006. -2. - С. 23-29. РЯБЦЕВА Е.С. и др. Весц нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя медыцынскх навук. - 2006. -1. - С. 81-87.6429013 1, 2002.(57) Способ предтрансплантационного культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека, отличающийся тем, что используют культуральную среду,содержащую обогащенную тромбоцитами аутоплазму периферической крови человека в количестве 20 . Изобретение относится к медицине, в частности к клеточной трансплантации, и может быть использовано для предтрансплантационной подготовки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека. Наиболее близким, принятым за прототип, является способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в пролиферативной среде, содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 100 /мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2-глутамина 1. Недостатком способа является а) наличие ксеногенных белков в культуральной среде создает угрозу развития анафилактических реакций и осложнений при последующей трансплантации человеку б) отсутствие аутогенных (человеческих) ростовых факторов в естественных (биологических) концентрациях в) длительные сроки культивирования для получения необходимого объема культуры клеток г) низкая жизнеспособность и скорость роста полученных культур клеток. Задачей настоящего изобретения является устранение высокой антигенной нагрузки при выполнении трансплантации человеку мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, связанной с культивированием в среде, содержащей чужеродный белок, снижение 17458 1 2013.08.30 сроков предтрансплантационного культивирования, повышение жизнеспособности и скорости роста культур клеток человека перед трансплантацией. Поставленная задача решается следующим образом предложен способ предтрансплантационного культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека, отличающийся тем, что используют культурную среду, содержащую обогащенную тромбоцитами аутоплазму периферической крови человека в количестве 20 . Для оценки влияния обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) на морфо-фенотипические особенности клеток использовалась культура мезенхимальных стволовых клеток(МСК) жировой ткани человека 5-го пассажа, культивируемая в присутствии 20 ОТП с заменой ОТП каждые 2 суток. Обогащенная тромбоцитами плазма получается из периферической аутокрови человека (20 мл), взятой с антикоагулянтом - гепарином в соотношении 20 МЕ на 1 мл, с последующим центрифугированием при 1300 об/мин в течение 10 мин, отделением плазмы с тромбоцитами от эритроцитов и лейкоцитов и повторным центрифугированием при 4000 об/мин 10 мин с последующим удалением бедной тромбоцитами плазмы, осадок, включающий тромбоциты и незначительную примесь эритроцитов и лейкоцитов, разводится в необходимом количестве культуральной среды, содержащей обогащенную тромбоцитами плазму до 20 . В качестве контроля рассматривалась аналогичная культура клеток, культивируемая в условиях 10 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Данные клеточные культуры характеризовались сходными морфологическими особенностями и были представлены фибробластоподобными веретеновидными клетками. В присутствии ОТП МСК обладали более вытянутой морфологией, при этом их жизнеспособность была достоверно выше, чем культуры клеток, содержащих ЭТС, и составляла 98 и 91,1 соответственно. Длительное культивирование клеток (до 8 дней) без замены культуральной среды не влияло на жизнеспособность клеток, что свидетельствует о высоком уровне и возможной постоянной продукции тромбоцитами ростовых факторов. Иммунофенотипический анализ показал, что данные культуры экспрессируют на одинаковом уровне маркеры, характерные для МСК - 90, 44, - (табл. 1). Высокий уровень экспрессии маркера активно пролиферирующих клеток - 71 свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток, культивируемых как в присутствии 10 ЭТС, так при содержании в культуральной среде 20 обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Таблица 1 Фенотипические особенности МСК, культивируемых в условиях 10 ЭТС и в присутствии обогащенной тромбоцитами плазмы Маркер Условия культивирования МСК 10 ЭТС 20 ОТП 90 90,192,244 94,896,571 89,7893,23,1 Секреторная активность МСК, культивируемых в присутствии 20 ОТП и в 10 ЭТС, оценивалась по способности клеточных культур продуцировать ангиогенный фактор роста - . Согласно данным, представленным в табл. 2, присутствие в культуральной среде ОТП повышает уровень продукции . Так, уровень продукциикультурами МСК жировой ткани в присутствии 10 ЭТС составлял 8456 и 8122 пг/мл, тогда как в присутствии ОТП на 4 и 12 дни культивирования МСК продуцировали 9017 и 8897 пг/млсоответственно. 2 17458 1 2013.08.30 Таблица 2 ПродукцияМСК, культивируемых в присутствии 20 ОТП и 10 ЭТС Условия культивироваКонцентрация , пг/мл ния МСК 4 дня культивирования 12 дней культивирования 20 ОТП 9017 8897 10 ЭТС 8456 8122 Для сравнения темпов роста МСК в питательной среде с добавлением ЭТС и в среде в присутствии обогащенной тромбоцитами плазмы человека были исследованы культуры МСК ЖТ 4-5 пассажей. По мере достижения конфлюэнтности на 7-10 сутки клетки были сняты с поверхности культурального пластика с помощью 0,25 трипсина-ЭДТА и посчитана их концентрация на мл среды. Число удвоений клеточных популяций рассчитывалось как 10 отношения числа клеток, полученных после трипсипизации, к числу посаженных клеток, умноженных на 3,33. Мониторинг скорости роста культур показал увеличение в 2 прироста клеток при культивировании в среде, содержащей 20 обогащенной тромбоцитами плазмы, по сравнению с культивированием с 10 ЭТС. Таким образом, предтрансплантационное культивирование МСК ЖТ человека в среде с 20 ОТП не влияет на морфо-фенотипические особенности МСК, повышает продукцию ими ангиогенного фактора роста, сохраняет высокую жизнеспособность МСК (98 ),ускоряет темп роста МСК даже при длительном культивировании без замены среды. Представленные данные свидетельствует о высокой практической эффективности предлагаемого способа. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3