Способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих

(51)12 5/06 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ И НЕРВНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Жук Ольга Николаевна Никандров Виталий Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(56) Руководство по культивированию нервной ткани. - М. Наука, 1988. - С. 37-42.2084523 С 1, 1997.2164240 2, 2001.2194753 2, 2002.2126832 С 1, 1999.1732516 1, 1995.00/26353 1.(57) Способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих, включающий использование синтетической питательной среды с добавлением фетальной телячьей сыворотки, отличающийся тем, что фетальную телячью сыворотку добавляют до концентрации 0,05 и дополнительно в среду добавляют плазминоген до концентрации(10-8-10-7) М. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к культивированию нервной ткани и нервных клеток млекопитающих. Известен способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих как для общебиологических исследований, так и для практического применения, в частности нейротрансплантации, заключающийся в том,что в синтетическую питательную среду добавляют сыворотку крови и культивируют в ней требуемую органотипическую или диссоциированную культуру 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является культивирование нервной ткани и нервных клеток млекопитающих путем использования синтетической питательной среды и добавления к ней биологически активной субстанции. Однако, недостатком прототипа является то, что для успешного культивирования нервной ткани синтетические среды требуют добавки биологически активных веществ. Применяемые для получения зрелых культур в качестве добавки сыворотка крови фетальных телят и сыворотка крови лошадей по отдельности или в комбинации позволяют получить зрелую,дифференцированную культуру нервной ткани и ее клеточных компонентов только через 10-14 суток культивирования. Задачей заявляемого способа является ускорение дифференциации и созревания культивируемых нервных клеток. Поставленная задача достигается следующим образом. 8301 1 2006.08.30 Предложен способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих,включающий использование синтетической питательной среды с добавлением фетальной телячьей сыворотки, при этом фетальную телячью сыворотку добавляют до концентрации 0,05 и дополнительно в среду добавляют плазминоген до концентрации (10-8-10-7) . Плазминоген представляет собой гликопротеин массой 85 кДа. Наиболее известна его функция в процессе фибринолиза. Кроме этого, плазминоген обнаружен в нервной ткани,где показан его синтез клетками микроглии 2. Введение его в питательную среду позволяет ускорить формирование зоны роста органотипической культуры нервной ткани. Пример 1. Органная культура. Неокортекс и мозжечок новорожденных крыс освобождают от оболочек, разделяют на фрагменты размером около 1 мм 3, которые располагают на покровные стекла с коллагеновой подложкой и помещают в пластиковые чашки Петри диаметром 3,5 см. В контрольную питательную среду дополнительно вносят 25 фетальной телячьей сыворотки, а в экспериментальную - 0,05 такой же сыворотки и(10-8-10-7) , полученного из плазмы крови человека. Все культуры помещают в инкубатор при 37 С и 5 содержанием СО 2. Рост и морфологию клеток учитывают на инвертированном микроскопе. С помощью окуляр-микрометра определяют индекс площади (ИП), который рассчитывают в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста, формируемой регенерирующими отростками и выселяющимися клетками, к исходной площади эксплантата 3-Чалисова, 2000. Значения ИП выражают в процентах, ИП контрольных эксплантатов принимают за 100 . Достоверность различий ИП контроля и эксперимента оценивают с помощью -критерия Стьюдента. При добавлении 25 сыворотки на первые сутки культивирования в органотипических культурах происходит прикрепление эксплантатов к коллагеновой подложке и их распластывание, а на 2-3 сутки - вырост тонких немиелинизированных аксонов по периферии эксплантата, дающий начало формированию зоны роста. К концу 3-х суток культивирования в зоне роста происходит миграция фибробластов, клеток нейроглии. ИП контрольных эксплантатов неокортекса составил 1,620,08 (20), а мозжечка -1,520,04(18). При добавлении в питательную среду, содержащую 0,5 указанной сыворотки, (10-810-7)к исходу 3-х суток отмечено значительное увеличение количества и длины отростков, а также их арборизации. Зона роста уплотнялась как в результате указанных процессов, так и за счет миграции из эксплантатов глиальных клеток, макрофагов и немногочисленных нейронов. ИП культур неокортекса равнялся 2,410,08 (16),мозжечка 2,400,1 (19). Различия размеров формируемой зоны роста, выраженные через ИП,составляют для органных культур неокортекса и мозжечка 49(Р 0,001) и 57(Р 0,001), соответственно. Это указывает на стимуляцию плазминогеном генерации отростков и миграции клеток в исследуемых культурах. Пример 2. Диссоциированная культура. Суспензию диссоциированных клеток неокортекса готовят по общепринятой методике с использованием раствора трипсина в конечной концентрации 0,1 . Посев производят в пластиковые матрасики (3,5 млн клеток в 5 мл питательной среды). Культивирование проводят в питательной средес добавлением гентамицина. В контрольную питательную среду дополнительно вносят 25 фетальной телячьей сыворотки, а в экспериментальную - 0,05 такой же сыворотки и(10-8-10-7) , полученного из плазмы крови человека. Все культуры помещают в инкубатор с температурным режимом 37 С и 5 содержанием СО 2. Исследуют на инвертированном микроскопе. Определяют процентное отношение прикрепленных клеток, а также клеток, генерирующих отростки. 2 8301 1 2006.08.30 3 сутки культивирования прикрепляемость клеток культур с добавлением 25 фетальной телячьей сыворотки - 80 , отростки появляются у единичных клеток. В культурах, в питательную среду которых добавлен(10-8-10-7) , прикрепляемость составила 87 , отростки появляются у большинства клеток. Это свидетельствует о повышении регенеративных процессов и созреваемости клеток. Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ обладает следующими преимуществами позволяет на 2-3 суток ускорить дифференцировку и созревание клеток. С учетом того, что плазминоген не обладает выраженной видовой специфичностью и его возможно получить из крови человека, данный способ может найти широкое применение в практической трансплантологии. Источники информации 1. Руководство по культивированию нервной ткани. - ., 1988. - С. 37-42 (прототип). 2. Чалисова Н.И., Мелькишев В.Ф., Акоев Г.Н., Людыно .И., Куренкова Т.Ю. Стимулирующее влияние пролактина на рост нейритов чувствительных нейронов в органотипической культуре // Цитология. - 1991. - Т. 33. -2. - С. 29-31. 3..,.,.,.,.//. - 1992. - . 308. - . 179-182. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3