Способ определения возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Зафранская Марина Михайловна Федулов Александр Сергеевич Нижегородова Дарья Борисовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеары костного мозга больного, получают из них путем культивирования мезенхимальные стволовые клетки 1-го пассажа, выделяют мононуклеары периферической крови того же больного, окрашивают их карбоксифлуоресцеином, в течение 10 дней культивируют в питательной среде, содержащей миелин-специфический протеин, с добавлением и без добавления мезенхимальных стволовых клеток 1-го пассажа, затем путем окрашивания моноклональными антителами к специфическим маркерам эффекторных Т-клеток памяти регистрируют в культурах пролиферацию эффекторных Т-клеток памяти в процентах и определяют коэффициент супрессиипролиферации указанных клеток в процентах по формуле П эффТМСК 100100,П эффТ где ПэффТМСК - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти при совместном культивировании мононуклеаров периферической крови с добавлением мезенхимальных стволовых клеток ПэффТ - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти в культуре мононуклеаров периферической крови без добавления мезенхимальных стволовых клеток,при этом при получении значенияболее 50 делают вывод о возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза. 14154 1 2011.04.30 Изобретение относится к медицине, к разделам аутоиммунной патологии, трансплантологии, клеточной биологии, нейроиммунологии и неврологии. Проблема лечения рассеянного склероза заключается в отсутствии эффективных протоколов, направленных на селективное подавление активности миелин-реактивных Т-лимфоцитов. Развитие перспективного направления патогенетической терапии аутоиммунных воспалительных демиелинизирующих заболеваний основывается на использовании иммуносупрессирующих и нейропротективных свойств мезенхимальных стволовых клеток,технология получения и культивирования которых является дорогостоящей процедурой. С другой стороны, эффективность использования клеточных культурможно предсказать, оценив степень иммуносупрессорного действия мезенхимальных стволовых клеток на миелин-специфический ответ лимфоцитов. Аналогов не обнаружено. Задачей заявляемого способа является определениевозможности аутологичных мезенхимальных стволовых клеток супрессировать миелин-специфический ответ эффекторных Т-клеток памяти с целью дальнейшего дифференцированного использования клеточных культур мезенхимальных стволовых клеток для эффективного патогенетического лечения рецидивно-ремиттирующей формы рассеянного склероза. Поставленная задача решается следующим способом. Предложен способ определения возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеары костного мозга больного, получают из них путем культивирования мезенхимальные стволовые клетки 1-го пассажа, выделяют мононуклеары периферической крови того же больного, окрашивают их карбоксифлуоресцеином, в течение 10 дней культивируют в питательной среде, содержащей миелин-специфический протеин, с добавлением и без добавления мезенхимальных стволовых клеток 1-го пассажа, затем путем окрашивания моноклональными антителами к специфическим маркерам эффекторных Т-клеток памяти регистрируют в культурах пролиферацию эффекторных Т-клеток памяти в процентах и определяют коэффициент супрессиипролиферации указанных клеток в процентах по формуле П эффТМСК 100100,П эффТ где ПэффТМСК - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти при совместном культивировании мононуклеаров периферической крови с добавлением мезенхимальных стволовых клеток ПэффТ - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти в культуре мононуклеаров периферической крови без добавления мезенхимальных стволовых клеток,при этом при получении значенияболее 50 делают вывод о возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза. Пример 1. Больной А., 39 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом рассеянный склероз,рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической венозной крови и пунктата костного мозга из грудины. Из полученного биологического материала методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин и последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеарные клетки. Мононуклеары периферической крови (МПК) были временно заморожены в жидком азоте. Мононуклеары костного мозга (МКМ) были использованы для получения 1-го пассажа мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК КМ). После достижения конфлюэнтности (80-100 покрытие поверхности клетками) культура МСК КМ была снята с пластика методом трипсинизации, отмыта физиологическим раствором и ресуспензирована в концентрации 2106 клеток/мл. Параллельно были разморожены МПК, отмыты физиологическим раствором, ресуспензированы в концентрации 2 14154 1 2011.04.30 1107 клеток/мл и окрашены внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином в концентрации 7 М в 1 мл культуральной среды -1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Внутриклеточное окрашивание останавливалось путем отмывания МПК полной культуральной средой (-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки). После этого МПК засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку и культивировались в присутствии МСК КМ, которые добавляли в соотношении 101, в течение 10 дней в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл миелинспецифического протеина, в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С с заменой на 6-й день супернатанта полной культуральной средой, содержащей 10 /мл интерлейкина-2,причем одновременно культивировались МПК без добавления МСК КМ в той же среде. Регистрация миелин-специфической пролиферации эффекторных Т-клеток памяти с фенотипом 37-45 осуществлялась на 10-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии окрашивались моноклональными антителами, меченными флуоресцентной меткой, к 3, 7 и 45 маркерам Т-клеток в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Пролиферация 37-45 эффекторных Т-клеток памяти в ответ на миелин-специфический протеин у больного А. Пролиферация 37-45 Т-клеток в суспензии МПК с добавлением МСК КМ (101),29,92 Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответапо формуле П эффТМСК 100 29,9210052,14.100100 П эффТ 62,52 Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответасоставил более 50 , что свидетельствует о наличии возможного терапевтического эффекта МСК КМ при использовании клеточных культур в патогенетическом лечении рассеянного склероза. В связи с этим больному А. рекомендовано проведение аутологичной трансплантации МСК КМ для иммунологической супрессии миелин-специфического ответа эффекторных Т-клеток памяти. Пример 2 Больной В., 32 года, поступил в отделение неврологии с диагнозом рассеянный склероз,рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической венозной крови и пунктата костного мозга из грудины. Из полученного биологического материала методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин и последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеарные клетки. МПК были временно заморожены в жидком азоте. МКМ были использованы для получения 1-го пассажа МСК КМ. После достижения конфлюэнтности (80-100 покрытие поверхности клетками) культура МСК КМ была снята с пластика методом трипсинизации, отмыта физиологическим раствором и ресуспензирована в концентрации 2106 клеток/мл. Параллельно были разморожены МПК, отмыты физиологическим раствором, ресуспензированы в концентрации 1107 клеток/мл и окрашены внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином в концентрации 7 М в 1 мл культуральной среды -1640 в течение 5 мин в темноте при 3 14154 1 2011.04.30 комнатной температуре. Внутриклеточное окрашивание останавливалось путем отмывания МПК полной культуральной средой (-1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина,25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки). После этого МПК засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2105 клеток/лунку и культивировались в присутствии МСК КМ, которые добавляли в соотношении 101, в течение 10 дней в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл миелин-специфического протеина, в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С с заменой на 6-й день супернатанта полной культуральной средой, содержащей 10 /мл интерлейкина-2, причем одновременно культивировались МПК без добавления МСК КМ в той же среде. Регистрация миелин-специфической пролиферации эффекторных Т-клеток памяти с фенотипом 37-45 осуществлялась на 10-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии окрашивались моноклональными антителами, меченными флуоресцентной меткой, к 3, 7 и 45 маркерам Т-клеток в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Пролиферация 37-45 Т-клеток в суспензии МПК с добавлением МСК КМ (101),38,22 Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответапо формуле П эффТМСК 100 38,2210032,91.100100 П эффТ 56,97 Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответасоставил менее 50 , что свидетельствует об отсутствии терапевтического эффекта МСК КМ при использовании клеточных культур в патогенетическом лечении рассеянного склероза. В связи с этим больному В. не рекомендовано проведение аутологичной трансплантации МСК КМ для иммунологической супрессии миелин-специфического ответа эффекторных Т-клеток памяти. Вывод. При определении коэффициента супрессии пролиферативного ответаболее 50 аутологичные МСК КМ могут быть использованы для патогенетического лечения больного рассеянным склерозом. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4