Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА(71) Заявители Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Квачева Зинаида Болеславовна Лобанок Елена Станиславовна Пыко Илья Васильевич Корень Сергей Викторович Амвросьева Тамара Васильевна Василевич Ирина Борисовна(73) Патентообладатели Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, включающий использование культурального флакона с ростовой средой, содержащей среду ДМЕМ, 2 мМ -глутамина, антибиотик, 15-20 эмбриональной телячьей сыворотки, отличающийся тем, что в среду дополнительно добавляют ростовой фактордо концентрации 10 нг/мл, а в качестве культурального флакона используют герметично закрываемый флакон цилиндрической формы радиусом 12,5-25,0 мм, изготовленный из нейтрального стекла, при этом культивирование мезенхимальных стволовых клеток осуществляют при горизонтальном расположении культурального флакона. Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной биологии, и может применяться в качестве способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК),избирательно повышая в суспензии клеток костного мозга адгезионную способность и пролиферативную активность МСК. Известны способы культивирования МСК 1, 2, 3, заключающиеся в том, что клетки инкубируют в пластиковых культуральных плоских флаконах площадью 25, 75 и 175 см 2 с плоской поверхностью для прикрепления клеток в ростовых средах, в состав которых входит среда ДМЕМ, 2 мМ -глутамина, 10 сыворотки плодов коров, с использованиемили без него, или готовые наборы для роста клеток различных фирм. В течение 16945 1 2013.04.30 10-14 суток культивирования в атмосфере 52 при 37 С наблюдают рост клеток в виде колоний с последующим формированием монослоя клеток. Уровни клеточной пролиферации оценивают по срокам достижения сатурации монослоя клеток и их плотности. Наиболее близким к изобретению является способ культивирования МСК мыши, описанный в статье .и др. 4. Клетки по этому способу выращивались в среде ДМЕМ с добавлением 15 эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ -глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина при 37 С и 52. Первичные культуры(0 пассаж) выращивались в пластиковых 6-луночных планшетах, при субкультивировании клетки первого пассажа помещали в пластиковые культуральные флаконы площадью 25 см 2. Недостатком известного способа является его длительность (клетки 0 пассажа получали через 2 недели, клетки первого пассажа - через 1 неделю) и сложность наработки больших количеств МСК, необходимость использования 2 инкубатора, возможность только одноразового использования культуральных флаконов. Задачей изобретения является создание условий для избирательного наращивания значительного количества биомассы МСК костного мозга, сокращение времени культивирования клеток до формирования плотного клеточного монослоя, повышение адгезии и пролиферативной активности МСК. Результат достигается в способе культивирования МСК, включающем использование культурального флакона с ростовой средой, содержащей среду ДМЕМ, 2 мМ -глутамина,антибиотик, 15-20 эмбриональной телячьей сыворотки. В среду дополнительно добавляют ростовой фактор до концентрации 10 нг/мл, а в качестве культурального флакона используют герметично закрываемый флакон цилиндрической формы радиусом 12,5-25,0 мм (для максимально быстрого прикрепления и накопления относительно небольших количеств клеток, и для накопления максимально возможного количества клеток в течение ограниченного временного промежутка). Культивирование МСК осуществляют при горизонтальном расположении культурального флакона. Применение указанных флаконов в большей мере соответствует условиям жизнедеятельности МСК в организме (условия), пространственной организации, присущей структуре кости и ориентации клеток в процессе их роста, размножения и развития в костном мозге 5. Известно использование культуральных флаконов цилиндрической формы, находящихся в горизонтальном положении, при культивировании перевиваемых клеточных линий. Однако в качестве культуральных флаконов при культивировании МСК их применение не известно. В настоящее время для культивирования МСК используют Т-образные флаконы,впервые предложенные Эрлом 6. Недостатками при применении этого типа флаконов является трудоемкость и сложность наработки больших количеств МСК, необходимость использования 2 инкубаторов, способность обеспечивать пролиферативную активность клеток лишь при специальной обработке внутренней поверхности культуральных флаконов (белками внеклеточного матрикса - фибронектин, ламинин), отсутствие производства в Республики Беларусь плоских культуральных флаконов с обработанной внутренней поверхностью и высокая стоимость таких флаконов у зарубежных фирм. Способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Клетки выделяют из костного мозга экспериментальных животных (мыши, крысы),полученного из бедренных, большеберцовых и плечевых костей животных. Костный мозг подвергают механической дезагрегации до образования клеточной суспензии. Выделение клеточной фракции МСК проводят используя способность этих клеток к адгезии к субстрату. Приготовленную клеточную суспензию объемом 2,5 мл, содержащую 1,0106 клеток/мл ростовой среды, в состав которой входят питательная среда ДМЕМ, глутамин, 20 сыворотки плодов коров, антибиотик (гентамицин) и 10 нг/мл , поме 2 16945 1 2013.04.30 щают в герметично закрытые цилиндрические стеклянные культуральные флаконы с радиусом 5,0 мм с необработанной внутренней поверхностью, находящиеся в горизонтальной плоскости. Первую смену среды проводят спустя одни сутки после посева клеток. В течение последующих 3-5 суток культивирования в термостате при 37 С наблюдают рост клеток в виде колоний с последующим формированием клеточного монослоя с преимущественным ростом фибробластоподобных (мезенхимальных стволовых клеток) клеток, составляющих в общей популяции не менее 70-80 . Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 7-9 суток. Пример 2. Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют с использованием цилиндрических,находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом 12,5 мм с необработанной внутренней поверхностью, в которые помещают 2,5 мл клеточной суспензии (1,0106 клеток/мл ростовой среды). Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток. Пример 3. Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют с использованием цилиндрических,находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 17,5 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые помещали 5 мл клеточной суспензии (1,0106 клеток/мл ростовой среды). Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток. Пример 4. Манипуляции, описанные в примере 1, выполняли с использованием цилиндрических,находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 25,0 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые помещали 10 мл клеточной суспензии (1,0106 клеток/мл ростовой среды). Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток. Пример 5. Манипуляции, описанные в примере 1, выполняли с использованием цилиндрических,находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 35,0 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые помещали 15 мл клеточной суспензии (1,0106 клеток/мл ростовой среды). Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 9-10 суток. Сравнительные уровни пролиферативной активности МСК при применении культуральных цилиндрических флаконов, находящихся в горизонтальном положении, и флаконов с плоской поверхностью для прикрепления клеток представлены в таблице. Форма культурального флакона Пластиковые плоские культуральные флаконы, покрытые коллагеном 1-го типа А (прототип) Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизонтальном положении, радиус кривизны 5,0 мм Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в 4. горизонтальном положении, радиус кривизны 12,5 мм Посевная доза кле- Процент адгези- Плотность ток в 1 мл ростовой рованных кле- клеток (в тысреды ток сячах) на 1 см 2 1106 16945 1 2013.04.30 Продолжение таблицы Форма культурального флакона Посевная доза кле- Процент адгези- Плотность ток в 1 мл ростовой рованных кле- клеток (в тысреды ток сячах) на 1 см 2 Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон 1106 20,22,1 88,24,7 тальном положении, радиус кривизны 17,5 мм Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон 1106 25,43,0 ххх 97,42,1 яяя) тальном положении, радиус кривизны 25,0 мм Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон 1106 7,22,1 36,14,5 тальном положении, радиус кривизны 35,0 мм Примечаниемежду хх) и х)0,01 ххх) и х)0,01 яя) и я)0,05, яяя) и я)0,05. Как видно из данных, представленных в таблице, предлагаемая форма культурального флакона - цилиндрическая, флакон находится в горизонтальном положении, кривизна радиуса поверхности стеклянного флакона от 12,5 до 25 мм обеспечивает больший уровень пролиферативной активности МСК по сравнению с прототипом. Отличие и преимущества предлагаемого способа состоят в простоте (не требуется специальная обработка внутренней поверхности флаконов для культивирования), более высокой адгезии клеток во флаконах с радиусом кривизны 12,5-25,0 мм в горизонтальном положении, экономичности (не требует использования 2 инкубатора, закупки импортных флаконов, позволяет многократно использовать флаконы), сокращении времени достижения сатурации клеточного монослоя за счет повышения пролиферативной активности клеток в условиях, соответствующих жизнедеятельности МСК, и пространственной организации, присущей структуре трубчатой кости, и при добавлении в среду роста МСК ростового факторав обеспечении возможности получения большего количества клеток за более короткие сроки с целью последующего их применения. Таким образом, предлагаемый способ повышения адгезионной способности, заключающийся в использовании культуральных флаконов, позволяет достичь большего уровня пролиферативной активности и адгезионной способности МСК при отсутствии необходимости применения 2 инкубатора, сокращения времени культивирования мезенхимальных стволовых клеток для получения достаточных количеств клеток для последующего их применения. Источники информации 1.. ..//. 2006. - . 7. - . 14. 2...,,//. - 2005. . 33. - . 1402-1416. 3...//. - 2006. - . 24. - . 1054-1064. 4...// . . . . - 2007. - . 51. - . 723-729. 4 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5