Способ экспансии мезенхимальных стволовых клеток

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ЭКСПАНСИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии(72) Авторы Исайкина Янина Ивановна Алейникова Ольга Витальевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии(57) 1. Способ экспансии мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга человека, отличающийся тем, что экспансию осуществляют в среде Дюльбекко в модификации Искова, при этом среда дополнительно содержит 10 эмбриональной телячьей сыворотки, -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М, причем съем клеток с поверхности экспансии осуществляют путем их обработки минимальным количеством трипсин-ЕДТА, который через 57 мин инактивируют добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки выделены из костного мозга здорового человека или человека с онкологическим заболеванием, получившего сеансы высокодозной химиотерапии и лучевой терапии, у которого снижена пролиферация мезенхимальных стволовых клеток. Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано в трансплантологии и онкологии. Экспансированныемезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут быть использованы как дополнительный трансплантат для регенерации поврежденных тканей мезодермального происхождения, для сокращения периода восстановления гемопоэза после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, для предотвращения реакции трансплантат против хозяина и в других областях медицины. В последнее десятилетие активно и успешно развивается такое направление в медицине, как клеточная терапия, большую роль в которой играет применение стволовых клеток, имеющих высокий потенциал к самовоспроизведению и дифференцировке. Используются не только неманипулированные аутологичные и аллогенные стволовые клетки, как при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, но успешно применяются стволовые клетки, подвергшиеся в связи со своей малочисленностью предварительной экспансии, например мезенхимальные стволовые клетки или хондроциты. При не 11560 1 2009.02.28 обходимости стволовые клетки могут подвергаться направленной дифференцировкев клетки ткани, нуждающейся в репарации. МСК после культивирования и экспансиимогут быть использованы как недифференцированными, так и стимулироваться для дифференцировки в клетки кости, хряща, сухожилия, мышцы, гепатоциты, а также в клетки, обладающие эндотелиальными и миогенными свойствами, что делает их привлекательными для разработки методов тканевой терапии. Мезенхимальные стволовые клетки получили свое название в связи со способностью этих клеток к самоподдержанию и дифференцировке в различные клеточные линии мезенхимы (остеоидную, хондрогенную, адипогенную) 1. Во всех исследованиях имеются в виду прилипающие клетки, образующие при культивированииколониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) и имеющие морфологию фибробластоподобных веретенообразных вытянутых клеток. МСК обладают большим пролиферативным потенциалом и, выделенные из костного мозга молодых доноров, могут осуществить 24-40 делений, при этом приумножив популяцию в 1 миллион раз 2, 3. Исследование фенотипических характеристик мезенхимальных клеток показало, что эти клетки негативны по гемопоэтическим поверхностным маркерам 34, 45, 14,31, 133 и позитивны по 44, 90, 105 (2), 166, 73 (3),140 4. Мезенхимальные стволовые клетки могут быть получены из различных источников костного мозга, жировой ткани и других тканей взрослого организма. Основной задачей при подготовке МСК для клинического применения является получение большого числа клеток. При любой технологии получения функционально эффективного для клеточной терапии объема МСК необходимо учитывать 3 основные составляющие процесса, а именно получение достаточного количества биологического материала, из которого будут выделены МСК способ выделения МСК экспансия (наращивание) мезенхимальных стволовых клетокв культуральных средах с добавлением различных биоактивных факторов, обеспечивающих пролиферацию МСК и, как следствие, получение нужного количества клеточного материала. Известен способ экспансии мезенхимальных стволовых клеток 5. В данной разработке для культивирования иэкспансии мезенхимальных клеток культуральная среда не содержит сыворотки, но в нее входят компоненты, обеспечивающие жизнеспособность и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток. Состав культуральной, так называемой полной среды 1) среда Дюльбекко в модификации Искова 2) сывороточный альбумин - 5 мг/мл 3) человеческий трансферин - 2 мкг/мл 4) человеческий рекомбинантный инсулин - 10 мкг/мл 5) глутамин - 1 мМ. После выделения по градиенту плотности на Перколе и отмывки в буфере фракция мононуклеарных клеток, ресуспендированная в полной среде, высаживалась в посуду для культивирования по 0,2106/см 2. Недостатком способа экспансии в представленной культуральной среде является ее сложность и многочисленность входящих в нее компонентов, что затрудняет использование ее для клинических целей, где требуются большие объемы мезенхимальных клеток. Некоторые составляющие предложенной культуральной среды являются компонентами сыворотки человека, что требует дополнительных мер безопасности при их использовании. Наиболее близким, принятым за прототип, является используемый в настоящее время в зарубежной клинической практике способ экспансии недифференцированных мезенхи 2 11560 1 2009.02.28 мальных стволовых клеток из костного мозга человека в Игла в модификации Дюльбекко с низким содержанием глюкозы (-), известной коммерческой среде, применяемой для роста адгезионных культур 6. Для экспансиимезенхимальных стволовых клеток к среде - добавляют 10 эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) определенной отселектированной серии, способствующей лучшей адгезии и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток. Мононуклеарные клетки были выделены из костного мозга на Перколе (градиент плотности 1,03-1,12 г/мл) и помещены в 10 см культуральную чашку в количестве 1107(0,18106 на см 2) клеток, ресуспендированных в -. Через 14 дней клетки основной культуры были сняты с поверхности чашки при помощи 0,25 трипсин-ЕДТА, отмыты в свежей среде - и в концентрации 3,5-4,0103 на см 2 пересажены в субкультуру (-й пассаж). Процедуру отмывки повторяют при каждом пассаже. Недостатками способа являются необходимость подбора сыворотки из разных серий (8-10) с последующим тестированием в течение нескольких дней. В связи с тем, что при экспансии МСК для клеточной терапии необходимо использовать значительный объем сыворотки для каждого пациента,такой подход делает метод более трудоемким, приводит к удлинению периода экспансии и удорожанию продукта неизбежная потеря значительного числа клеток при каждой отмывке снятых с поверхности флакона клеток от трипсин-ЕДТА, производимой перед каждым пассажем, препятствует быстрой экспансии мезенхимальных клеток до эффективного количества. Эти недостатки затрудняют использование способа при экспансии больших объемов мезенхимальных стволовых клеток для клинического применения. Задача, на решение которой направлен предлагаемый способ экспансии, заключается в наращиваниибольшого количества мезенхимальных стволовых клеток как из костного мозга донора, так и из костного мозга пациентов с онкологическими заболеваниями, для дальнейшего применения в трансплантологии и онкологии. Поставленную задачу решают путем культивирования клеток в среде для быстро пролиферирующих культур Дюльбекко в модификации Искова, содержащей 10 эмбриональной бычьей сыворотки независимо от серии, -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М. Таким образом, за 3 пассажа увеличивают количество мезенхимальных стволовых клеток у взрослого донора в среднем в 104 раз, у донора детского возраста в среднем в 105 раз, у пациента с онкологическим заболеванием в 104 раз. При субкультивировании мезенхимальные клетки после проведения каждого пассажа не подвергают отмывке от 0,25 трипсин-ЕДТА, инактивированного эмбриональной бычьей сывороткой. Способ осуществляют следующим образом. Костный мозг в объеме 20-30 мл получают от донора костного мозга или от пациента посредством костномозговой пункции под анестезией шприцом, содержащим 1 мл гепарина. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют из костного мозга, предварительно разведенного в соотношении 11 раствором Хэнкса, обычным способом по градиенту плотности на Гистопаке-1077 (, США) согласно инструкции, центрифугированием при 400 в течение 30 мин с последующим переносом слоя мононуклеаров трансферной пипеткой в центрифужную пробирку и двукратной отмывкой выделенных клеток в растворе Хенкса, с центрифугированием при 250 в течение 10 мин. Отбирают пробу МНК для теста на колониеобразующие единицы фибробластов(КОЕ-Ф тест), который показывает число пролиферирующих мезенхимальных стволовых клеток, приходящихся на 1105 мононуклеарных клеток костного мозга. 3 11560 1 2009.02.28 Мононуклеарные клетки ресуспендируют в полной среде, состоящей из(, США) с 10 ЭТС (, США) любой серии, глутамина в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанола в конечной концентрации 10-4 М. Клетки переносят в концентрации 3106 /мл (или 0,5-0,6106 клеток на см 2) во флакон объемом 175 см 2 (, Германия) в 30 мл среды. Клетки инкубируют при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере. Через 48 часов производят смену среды, удаляя таким образом неадгезированные клетки, находящиеся в суспензии, так как этого времени достаточно, чтобы мезенхимальные стволовые клетки прикрепились к поверхности пластика флакона. Через каждые 4 дня производят смену среды. При 80-90 покрытии поверхности флакона прикрепленными клетками их снимают при помощи 0,25 трипсин-ЕДТА (, США), проводят обработку поверхности флакона с прикрепленными клетками минимальным количеством (4 мл для флакона площадью 175 см 2) трипсин-ЕДТА в течение 5-7 минут при 37 С, затем трипсин инактивируют 2 мл ЭТС. Снятые таким способом клетки ресуспендируют в, подсчитывают в камере Горяева и в количестве 1-2106 без отмывки,которая приводит к потере клеток, пересаживают в новые культуральные флаконы 175 см 2(-й пассаж). Таким образом производят несколько пассажей до получения количества МСК, составляющего не менее 1106 /кг веса тела пациента. После проведения ряда пассажей и роста в культуре число МСК увеличивается в среднем в 104 - 105 раз. Иммунофенотипический анализ полученныхклеток проводят с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромамии РЕ, к поверхностным антигенам 105, 90, 140, 34, 45, 14 с использованием метода проточной цитофлуориметрии на аппарате( , США). Проводят анализ полученного клеточного материала на стерильность. Таким образом, представленное изобретение касается оптимизации способа экспансии недифференцированных МСК, в результате которой большой объем клеток получают из минимально возможного количества костного мозга в предельно короткий срок не только от здорового донора, но и от пациента с онкологическим заболеванием, получившего высокодозную полихимиотерапию или лучевую терапию и у которого снижена пролиферация МСК. Пример 1. Костный мозг в количестве 20 мл был получен от здорового донора в возрасте 42 лет,являвшегося аллогенным донором гемопоэтических стволовых клеток для своего ребенка. Результат теста на КОЕ-Ф был - 8 колоний на 105 мононуклеарных клеток костного мозга. Мононуклеарные клетки были выделены из костного мозга на Гистопаке - 1077(, США) в количестве 90106 и двукратно отмыты в растворе Хенкса. Затем МНК были ресуспендированы в 30 мл полной среды ( (, США) с 10 ЭТС(, США), содержащей -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М), и перенесены во флакон 175 см 2 (, Германия). Клетки инкубировали в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере. Через 48 ч была произведена смена среды. Через 13 дней образовался 90 слитный слой прикрепленных фибробластоподобных клеток, которые были сняты при помощи 4 мл 0,25 трипсин-ЕДТА (, США) в течение 5-7 мин при 37 С, затем трипсин был инактивирован 2 мл ЭТС. В результате роста в основной культуре было получено 5106 клеток. Снятые таким способом клетки ресуспендировали в полной среде и в количестве 1106 без предварительной отмывки от инактивированного сывороткой трипсин-ЕДТА,пересадили в 5 культуральных флаконов 175 см 2 (-й пассаж). Через 7 дней роста субкультуры в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере был получен 904 11560 1 2009.02.28 слитный слой морфологически однородных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и произведенпассаж, аналогично первому. После подсчета было получено 25106 МСК. Клеткипассажа были пересажены в 16 культуральных флаконов 175 см 2 в 30 мл полной среды и помещены в СО 2 инкубатор. Через 10 дней культивирования был получен 80 слитный слой и клетки были сняты с поверхности флаконов, как описано ранее( пассаж), в количестве 72106 клеток. Первоначально по результатам КОЕ-Ф теста в костном мозге донора из 90106 МНК находилось 7,2103 активно пролиферирующих МСК. В результате экспансиинашим способом с учетом результата КОЕ-Ф теста в течение 30 дней преумножено число МСК в 1104 раз. После идентификации клеток на проточном цитофлуориметре на наличие поверхностных антигенов 105, 90, 140, 34, 45, 14 были получены следующие результаты 105 - 96,21 , 90 - 91,72 , 140 - 11,97 , 34 - 0 , 45 - 4,39 ,14 - 3,1 . Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК,так как клетки положительны по 105 и 90, отрицательны по 34, 45, 14 и частично положительны по 140. Пример 2. Костный мозг в количестве 20 мл был получен от здорового донора в возрасте 14 лет,являющегося донором аллогенного костного мозга для родного брата. Результат теста на КОЕ-Ф был - 25 колоний на 105 мононуклеарных клеток костного мозга. Мононуклеарные клетки были выделены из костного мозга на Гистопаке-1077 (, США) в количестве 125106 и двукратно отмыты в растворе Хенкса. Затем МНК были ресуспендированы в 30 мл полной среды ( (, США) с 10 ЭТС (, США), содержащей -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2 меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М), и перенесены во флакон 175 см 2(, Германия). Клетки инкубировали в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере. Через 48 ч была произведена смена среды. Через 14 дней образовался 90 слитный слой прикрепленных фибробластоподобных клеток, которые были сняты при помощи 4 мл 0,25 трипсин-ЕДТА (, США) в течение 5-7 мин при 37 С, затем трипсин был инактивирован 2 мл ЭТС. В результате роста в основной культуре было получено 19106 клеток. Снятые таким способом клетки ресуспендировали в полной среде и в количестве 1106 без предварительной отмывки от инактивированного сывороткой трипсин-ЕДТА, пересадили в 10 культуральных флаконов 175 см 2 (-й пассаж). Через 6 дней роста субкультуры в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере был получен 90 слитный слой морфологически однородных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и произведенпассаж, аналогично первому. В результате было получено 41106 МСК. Клеткипассажа были пересажены в 20 культуральных флаконов 175 см 2 в 30 мл полной среды и помещены в СО 2 инкубатор. Через 7 дней культивирования был получен 90 слитный слой и клетки были сняты с поверхности флаконов, как описано ранее ( пассаж), в количестве 110106 клеток. Клеткипассажа были пересажены в 55 культуральных флаконов 175 см 2 в 30 мл полной среды и помещены в СО 2 инкубатор. Через 7 дней культивирования был получен 80 слитный слой и клетки были сняты с поверхности флаконов, как описано ранее ( пассаж), в количестве 335106 клеток. Первоначально по результатам КОЕ-Ф теста в костном мозге донора из 125106 МНК находилось 3,1104 активно пролиферирующих МСК. В результате экспансиина 5 11560 1 2009.02.28 шим методом с учетом результата КОЕ-Ф теста нам удалось в течение 34 дней преумножить число МСК в 1104 раз. После идентификации клеток на проточном цитофлуориметре на наличие поверхностных антигенов 105, 90, 140, 34, 45, 14 были получены следующие результаты 105 - 96,21 , 90 - 91,72 , 140 - 11,97 , 34 - 0 , 45 - 4,39 ,14 - 3,1 . Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК,так как клетки положительны по 105 и 90, отрицательны по 34, 45, 14 и частично положительны по 140. Пример 3. Костный мозг в количестве 30 мл был получен от подростка 14 лет с неходжкинской В-клеточной лимфомойстадии. До момента эксфузии костного мозга больной получил 4 блока высокодозированной полихимиотерапии и блок лучевой терапии. Результат теста на КОЕ-Ф был - 5 колоний на 105 мононуклеарных клеток костного мозга. Мононуклеарные клетки были выделены из костного мозга на Гистопаке-1077 (,США) в количестве 320106 и двукратно отмыты в растворе Хенкса. Затем МНК были ресуспендированы в 30 мл полной среды ( (, США) с 10 ЭТС (,США), содержащей -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М), и перенесены в 4 флакона 175 см 2 (, Германия). Клетки инкубировали в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере. Через 48 ч была произведена смена среды. Через 11 дней образовался 90 слитный слой прикрепленных фибробластоподобных клеток, которые были сняты с поверхности каждого флакона при обработке 4 мл 0,25 трипсин-ЕДТА (, США) в течение 5-7 мин при 37 С, после чего трипсин был инактивирован 2 мл ЭТС. В результате роста в основной культуре было получено 20106 клеток. Снятые клетки переносили в полную среду и в количестве 2106 без предварительной отмывки от инактивированного сывороткой трипсин-ЕДТА, пересадили в 10 культуральных флаконов 175 см 2 (-й пассаж). Через 7 дней роста субкультуры в СО 2 инкубаторе при 37 С в 5 СО 2 во влажной атмосфере был получен 90 слитный слой морфологически однородных фибробластоподобных клеток и произведенпассаж, аналогично первому. После подсчета было получено 60106 МСК. Клеткипассажа были пересажены в 30 культуральных флаконов 175 см 2 в 30 мл полной среды и помещены в СО 2 инкубатор. Через 7 дней культивирования был получен 90 слитный слой и клетки были сняты с поверхности флаконов, как описано ранее ( пассаж), в количестве 93106 клеток. Клеткипассажа были пересажены в 46 культуральных флаконов 175 см 2 в 30 мл полной среды и помещены в СО 2 инкубатор. Через 5 дней культивирования был получен 80 слитный слой и клетки были сняты с поверхности флаконов, как описано ранее ( пассаж), в количестве 180106 клеток. Первоначально по результатам КОЕ-Ф теста в костном мозге больного из 320106 МНК находилось 1,6104 активно пролиферирующих МСК. В результате экспансиинашим способом с учетом результата КОЕ-Ф теста нам удалось преумножить число МСК в 1,25104 раз. Идентификация клеток на проточном цитофлуориметре на наличие поверхностных антигенов дала следующие результаты 105 - 98,14 , 90 - 94,26 , 140 - 34,18 ,34 - 0,03 , 45 - 0,5 , 14 - 0,04 . Экспрессия поверхностных маркеров соответствует иммунофенотипу МСК, так как клетки положительны по 105, 90 и 140 и отрицательны по 34, 45, С 14. Таким образом, предлагаемый способ экспансии мезенхимальных стволовых клетокв средес 10 ЭТС, содержащей -глутамин в конечной концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 10-4 М, обладает следующими преимуществами и позволяет 6 11560 1 2009.02.28 ограничить внесение дополнительных ингредиентов в питательную среду, что минимизирует возможность бактериальной и вирусной контаминации исключить необходимость подбора сыворотки из разных серий (8-10) с последующим тестированием, что делает метод менее трудоемким и более экономически выгодным проводить экспансию МСК в течение короткого срока (от 30 до 35 дней) использовать незначительное количество костного мозга (от 20 до 30 мл) преумножить первоначальное количество имеющихся в костном мозге МСК в 104105 раз и получить достаточное количество для дальнейшего клинического применения мезенхимальных стволовых клеток не только от здорового донора, но и от пациента с онкологическим заболеванием. Источники информации 1..1994 21429-35. 2..,.,..2000 1131161-66. 3..,.,.,.,.- .2002 30699-04. 4.,,,.,.,, ,,..1999 284143-47. 5.5,908,7821, 1999. 6.5,486,359, 1996 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7