Способ создания калибратора ДНК Trichomonas vaginalis

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ СОЗДАНИЯ КАЛИБРАТОРА ДНК(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Костюк Светлана Андреевна Бадыгина Наталья Александровна Полуян Ольга Сергеевна Руденкова Татьяна Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(56)11635 1, 2009.10314 1, 2008.2358013 2, 2009.2350650 2, 2009.11089597 , 1999. КОСТЮК С.А. и др. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя медыцынскх навук. - 2006. -5. - С. 74-76.(57) Способ создания калибратора ДНК, заключающийся в том, что выделяют ДНК человека из лейкоцитов периферической крови и определяют ее концентрацию по концентрации однокопийного гена , выделяют ДНКи определяют ее концентрацию по концентрации однокопийного гена пируватферредоксин-оксидоредуктазы, с учетом определенных концентраций готовят растворы в деионизированной воде ДНК человека и ДНКс концентрациями 105, 104, 103 и 102 копий/мл и смешивают растворы ДНК человека и ДНК, взятые в одинаковых концентрациях, в объемном соотношении 11. Изобретение относится к области медицины, а именно к способам создания калибратора ДНКдля построения калибровочных кривых, относительно которых проводят определение концентрации ДНК искомого возбудителя в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Разработанный способ создания калибратора ДНКдля проведения ПЦР в режиме реального времени позволяет получить калибратор с известной концентрацией ДНК, который по своим молекулярно-биологическим свойствам и составу максимально приближен к биологическому материалу, полученному от пациента. Аналогов прототипа не обнаружено. Задачей заявленного способа является получение калибратора ДНКс известной концентрацией ДНК, содержащего ДНК человека, для построения калибровочной кривой при определении относительной концентрации ДНКв биологическом материале методом ПЦР в режиме 16353 1 2012.10.30 реального времени с показателями корреляции (2) междуи 10 концентрации ДНК в мл 0,9, эффективностью реакции 0,89. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ создания калибратора ДНК, заключающийся в том, что выделяют ДНК человека из лейкоцитов периферической крови и определяют ее концентрацию по концентрации однокопийного гена , выделяют ДНКи определяют ее концентрацию по концентрации однокопийного гена пируватферредоксин-оксидоредуктазы, с учетом определенных концентраций готовят растворы в деионизированной воде ДНК человека и ДНКс концентрациями 105, 104, 103, 102 и смешивают растворы ДНК человека и ДНК, взятые в одинаковых концентрациях, в объемном соотношении 11. Предложенный способ поясняется графическим материалом. На фигуре представлено- значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются, где 1 - пороговая линия, 2 - кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта. Для приготовления калибратора ДНКиз питательной среды СВТ-ж (НИИЭМ им. Пастера, РФ) ДНКвыделяли с использованием сорбентного метода. Расчет концентрации ДНКпроводили по формулам 1 и 2(1)260,где- концентрация ДНК в растворе (мкг/мл) 260 - значение спектрофотометрии раствора ДНК при 260- коэффициент пересчета для двухцепочечной молекулы ДНК,где- концентрация однокопийного гена- концентрация ДНК возбудителя в растворе (мкг/мл), рассчитанная по формуле 1- размер генома- средняя масса нуклеотида (321,44106 мкг)- число Авогадро (6,0223). Затем разводили полученный раствор ДНКдеионизированной водой до концентраций 105, 104, 103, 102 копий/мл. Геномную ДНК человека выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием набора(, США) в соответствии с инструкцией производителя. Расчет концентрации ДНК человека проводили по формулам 1 и 2, а затем разводили полученный раствор ДНК человека деионизированной водой до концентраций 105, 104, 103, 102 копий/мл. Конечным этапом при создании калибратора ДНКбыло смешивание в соотношении 11 образцов с соответствующими концентрациями однокопийного генаи однокопийного гена человека , таким образом,получили калибратор, состоящий из четырех образцов, содержащих 1) 105 копий/мл генаи 105 копий/мл гена человека 2) 104 копий/мл генаи 104 копий/мл гена человека 3) 103 копий/мл генаи 103 копий/мл гена человека 4) 102 копий/мл генаи 102 копий/мл гена человека . Пример апробации калибратора ДНК. Методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени проведена амплификация в дублях четырех образцов калибратора, содержащих 1) 105 копий/мл генаи 105 копий/мл гена человека 2) 104 копий/мл генаи 104 копий/мл гена человека 3) 103 копий/мл гена 2 16353 1 2012.10.30 и 103 копий/мл гена человека 4) 102 копий/мл генаи 102 копий/мл гена человека . Для амплификации генаи гена человекав пробирки типаобъемом 0,2 мл добавляли 15 мкл амплификационной смеси, состоящей из 6,85 мкл деионизованной воды, 2,5 мкл реакционной смеси (100 мМ - ( 8,4),50 мМ в ), 4 мкл 25 мМ 2, 0,2 мкл 25 мМи 1,25 смеси, содержащей 20 кратную концентрацию праймеров и -проб (конечная концентрация - 300 нМ праймеров и 200 нМ зондов) и 0,2 мкл -полимеразы. Добавляли 25 мкл минерального масла. Под слой масла вносили по 10 мкл анализируемого образца, содержащего определенную концентрацию однокопийного генаи однокопийного гена человека , а в пробирку отрицательного контроля - 10 мкл деионизированной воды. Амплификацию проводили с использованием термоциклера 6000 ( , Австралия) по следующей программе 95 С - 10 мин 50 циклов 95 С - 10 с,60 С - 35 с, 72 С - 15 с. Для амплификации генаиспользовали следующие последовательности праймеров и зондов 53(-праймер 1), 53(-праймер-2), 53 (-зонд). Для амплификации гена человекаиспользовали следующие последовательности праймеров и зондов 53(-праймер-1), 53 (-праймер-2), 53(-зонд). Каждый образец был проамплифицирован в дублях вместе с двумя().реактив состоял из сложной ДНК амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта была заменена водой. После амплификации ДНКи ДНК человека кинетика амплификации -проб не детектировалась. Средний уровень корреляции (2) междуи 10 концентрации гена(копий/мл) и междуи 10 концентрации гена человека(мкг/мл), содержащихся в созданном калибраторе ДНК, составил 0,99 и 0,98 соответственно. Средняя эффективность реакции составила 0,91 для ДНКи 0,89 для гена человека . Таким образом, заявленный способ позволяет получить следующие преимущества создать калибратор с известной концентрацией ДНК, по своим молекулярно-биологическим свойствам и составу максимально приближенный к биологическому материалу, полученному от пациента, что позволит при его использовании построить калибровочную кривую с показателями корреляции (2) междуи 10 концентрации ДНК в мл 0,9 и эффективностью реакции 0,89 и получить достоверную информацию об относительной концентрации ДНК возбудителя в биологическом материале. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3