Способ создания андрогенных регенерантов в культуре пыльников in vitro у ячменя (H.vulgare)

12 5/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ СОЗДАНИЯ АНДРОГЕННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВУ ЯЧМЕНЯ (.)(71) Заявитель РНИУП Институт земледелия и селекции НАН Беларуси(72) Авторы Гурецкая Валентина Станиславовна Шишлов Михаил Петрович Гордей Иван Андреевич(73) Патентообладатель РНИУП Институт земледелия и селекции НАН Беларуси(57) Способ создания андрогенных регенерантов в культуре пыльникову ячменя,включающий выращивание донорных растений, холодовую предобработку колосьев, эксплантацию пыльников на питательную среду и культивирование, отличающийся тем, что донорные колосья с микроспорами на одноядерной стадии развития предобрабатывают в питательном растворе Кнопа, содержащем этрел и бензимидазол в концентрациях 4 и 5 мг/л,соответственно, а пыльники эксплантируют на агаризованную питательную среду, содержащую бензимидазол и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту в концентрациях 5 мг/л.(56)1822683 1, 1993.95102120 , 1997.1036306 , 1983.94/01999 1. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетике и селекции, и может быть использовано для ускоренного получения гомозиготных ди-гаплоидных линий, а также для создания исходного материала в селекции растений. По современным представлениям наибольшей потенциальной эффективностью получения гаплоидов обладает метод культуры пыльников, с совершенствованием которого связывают решение проблем массового получения гаплоидов ячменя и злаковых культур. Известны способы получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников 1, 2, способ получения злаковых культур из пыльцы 3, способ регенерации растений в культуре ткани 4. Также разработан способ индукции новообразований и регенерантов в культуре пыльникову озимых гексаплоидного тритикале и пшеницы 5. Суть метода заключается в том, что семена донорных растений облучают -лучами в дозе 5-10 кР, пыльники высаживают на питательную среду . Однако недостатком данного способа является то, что -облучение семян донорных растений приводит к ухудшению генотипа вследствие индукции отрицательных мутаций, при этом выход зеленых регенерантов недостаточно вы 5799 1 сокий. А также необходимо иметь специальную подготовку для работы на установке ЛМД-1 (цезий 137) мощностью 3000 Р/мин. Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в том, что проводят предобработку донорных колосьев с микроспорами на одноядерной стадии развития раствором Кнопа с биологически активными веществами этрелом в концентрации 4 мг/л и бензимидазолом (БМД) в концентрации 5 мг/л. Пыльники высаживают на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) с модификаторами БМД в концентрации 5 мг/л,2,4,5 - трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) в концентрации 4 мг/л. Сущность изобретения заключается в том, что андрогенные регенеранты в культуре пыльникову ячменя получают путем выращивания донорных растений, эксплантации пыльников на агаризованную питательную среду и дальнейшего культивирования. При этом колосья донорных растений подвергают предобработке биологически активными веществами - этрелом (в концентрации 4 мг/л) и БМД (в концентрации 5 мг/л), пыльники высаживают на питательную среду МС с модификаторами БМД (в концентрации 5 мг/л),2,4,5-Т (в концентрации 4 мг/л). В предлагаемом способе исследования проводят на сортах ячменя. Метод культуры пыльников предполагает следующую систему получения дигаплоидов ячменя, которая является контролем в наших исследованиях 1 этап. Предобработка срезанных колосьев при температуре 4 С, с экспозицией 3-8 суток. 2 этап. Посадка пыльников на питательную среду МС с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) в концентрации 4 мг/л. 3 этап. Инкубация пыльников при температуре 25-28 С в течение 4-5 недель до появления каллусов. 4 этап. Посадка каллусов на регенерационную среду МС без гормонов. 5 этап. Дигаплоидизация полученных гаплоидных растений, посадка в почву, культивирование и получение семенного потомства дигаплоидов. В предлагаемом способе в качестве биологически активных соединений используют вещества, обладающие ауксиновой, цитокининовой активностью, в частности этрел, БМД,2,4,5-Т для изменения фитогормонального баланса и усиления пролифирации клеток. Донорные колосья выдерживают при температуре 4 С в питательном растворе Кнопа с добавлением этрела - ССН 2 СН 2 РО 3 (в концентрации 4 мг/л) - этиленпродуцирующего соединения, участвующего в действии физиологически активных веществ на ростовые процессы и БМД - 762 - соединения цитокининовой природы (в концентрации 5 мг/л). БМД поддерживает метаболизм в изолированных органах и тканях, участвует в биогенезе хлорофилла, проявляет цитокининовую активность и является макроэргическим соединением. Пыльники высаживают на агаризованную питательную среду МС с модификаторами БМД в концентрации 5 мг/л, 2,4,5-Т - индуктора каллусогенеза в концентрации 4 мг/л,что также приводит к усилению индукции зеленых растений. Каллусы культивируют на стандартной регенерационной среде МС без гормонов. Данные, приведенные в табл. 1, указывают на эффективность применения биологически активных соединений. При обработке колосьев этрелом и БМД выход регенерантов увеличивается в 1,7 раза по сравнению с контролем. При использовании БМД и 2,4,5-Т в качестве модификаторов среды для культивирования пыльников выход регенерантов возрастает в 2,1 и 2,4 раза соответственно. При суммарном действии предобработки и добавлением в питательную среду биологически активных соединений выход регенерантов возрастает в 3,5 раза, при этом частота индукции общего количества регенерантов составляет 20,7 и зеленых регенерантов - 16,2 . Данные, приведенные в таблице 2, 3, подтверждают наличие положительного эффекта влияния фитогормонов,- критерий фактический превышает табличное значениево 5799 1 всех трех вариантах, т.е. для индукции каллусогенеза, для общего выхода регенерантов и выхода зеленых регенерантовфактическое большетабличного. Предполагаемый способ позволяет увеличить выход зеленых гаплоидных растений при обработке донорных колосьев совместно растворами этрела и бензимидазола, а также добавлением в питательную среду растворов БМД, 2,4,5-Т, что повышает эффективность метода получения гаплоидных растений через культуру пыльников. Таблица 1 Влияние фитогормонов на эффективность индукции новообразований в культуре пыльниковячменя Количество Частота индукции ноКоличестрегенерантов вообразований,Количество во индувысажензелецированрегененых пыльзеле- каллуных ных кал- общее рантов,ников ных сов регенелусов всего рантов Холодовая предобработка колосьев, среда МС 2,4-Д для пыльников, контроль Холодовая предобработка колосьевэтрел (4 мг/л)БМД(5 мг/л), среда МС 2,4-Д для пыльников Холодовая предобработка колосьев, среда МС 2,4,5-Т(4 мг/л) для пыльников Холодовая предобработка колосьев, среда МСБМД(5 мг/л) для пыльников Холодовая предобработка колосьев, этрелБМД, среда МСБДМ (5 мг/л)2,4,5-Т Таблица 2 Дисперсионный анализ Компоненты дисперсии Каллусы Общая сумма Между вариантами Между повторностями Случайное НСР 05 табл. Общая сумма 66,26 14 50,89 4 3,56 2 11,82 8 2,29 2,3 Общее количество регенерантов 41,67 14 3 5799 1 Между вариантами Между повторностями Случайное НСР 05 Общая сумма Между вариантами Между повторностями Случайное НСР 05 Таблица 3 Однофакторный дисперсионный комплекс по влиянию фито-гормонов на частоту индукции новообразований в культуре пыльниковВариант применения фитогормонов Холодовая предобработка, среда 10,7 8,3 МС 2,4-Д Холодовая предобработка, этрелБМД,11,8 10,2 МС 2,4-Д Холодовая обработка, МС 2,4,5-Т 12,5 14,2 Холодовая предобработка, МСБМД 9,1 10,6 Холодовая предобработка, этрелБМД,15,7 12,4 МСБМД 2,4,5-Т Общее количество регенерантов Холодовая предобработка, среда 2,5 2,1 МС 2,4-Д Холодовая предобработка, этрелБМД,3,1 3,9 МС 2,4-Д Холодовая обработка, МС 2,4,5-Т 4,9 5,7 Холодовая предобработка, МСБМД 3,9 4,7 Холодовая предобработка, этрелБМД,6,5 7,7 МСБМД 2,4,5-Т Зеленые регенеранты Холодовая предобработка, среда 1,8 2,1 МС 2,4-Д Холодовая предобработка, этрелБМД,2,0 2,4 МС 2,4-Д Холодовая обработка, МС 2,4,5-Т 2,9 3,6 Холодовая предобработка, МСБМД 3,2 3,6 Холодовая предобработка, этрелБМД,4,9 5,6 МСБМД 2,4,5-Т Источники информации 1. Горбунова В.Ю., Кудоярова Г.Р., Надольская С.Н., Докичева Р.А., Кужлева Н.Г. Способ получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников. А.с. 1650051, 1988. 4 5799 1 2. Суханов В.М., Тырнов , Салтыкова Н.Н. Способ получения растений пшеницы из пыльцы в культуре пыльников. А.с. 1036306, 1983. 3. Зайкина Т.Ф., Суханов В.М., Тырнов Способ получения растений злаковых культур из пыльцы. А.с. 1276309, 1985. 4. Махновская М.Л., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Способ регенерации растений в культуре ткани. А.с. 1380689, 1985. 5. Сорокин А.П., Гордей И.А., Гордей Г.М., Шишлов М.П., Островская Т.И. Способ индукции новообразований и регенерантов в культуре пыльникову озимых гексаплоидного тритикале и пшеницы. А.с. 1822683, 1992. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5