Способ дестабилизации микробного сычужного фермента

Изобретение относится к способу дестабилизации микробного сычужногофермента. В производстве сыра молоко сверч тывают для отделения творога от сы 5воротки. Для этих целей используют продукты, содержащие реннин, который является свертывающим молоко энзимом,выделениы из желудка теленка.Известно несколько заменителей сычужного фермента теленка, включающих известные микробные сычужные ферменты из Мисог ш 1 еЬе 1 и Нцсог рцз 111 и 5 1.Сьщужный фермент, вырабатьшаемый 5 Мисог т 1 еЪе 1, предпочтителен в сыро варении благодаря его низкой стоимости, низкой неспецифической протеолитической активности и большомутого, Мцсог т 1 еЬе 1 отличается стабильностью при хранении сычужного фермента, что объясняется его высокой термостабильностью. 25Некоторые пастеризованные сыворотки используются в качестве добавок к цельному молоку, например, в виде порошка для получения обогащенного молока, например детского питания. Пастеризованная сыворотка, полученная из сыра, изготовленного с помощью сычужного фермента Млсог ш 1 еЬе 1, имеет незначительный уровень активности сычужного фермента благодаря высокой термостабильности последнего, продуцируемого Мцсог т 1 еЬе 1. д Известен способдестабилизации микробного сыучного фермента пос редством химической модификации,.осу-до ществляемой путем обработки сычужного фермента модифицнрующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, где в качестве модифицирующего агента используют цианат капия 2.Д 5Полученный карбамилированный продукт термически менее стабилен. Однако дестабилизация карбамилированногоЦелью изобретения является слит дожение термической стабильности мик робного сычужного фермента.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу дестабилизацииЕ мкробного сьшужного фермента пос 55редством химической модификации, осуществляемой путем обработки фермен та модифицирующим агентом при опти мальной температуре в водной среде,в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободныш галогенов хлор, бром или под или их производные, в которых галоген имеет число окисления 1-3, а массовое отношение окислителя к Общему содержанию белка в реакционной смеси составляет 0,01-1,0.Обработку микробного сьщужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровня дестабилизации 5-11 С при потере активности до 50 предпочтительно до 30, а в качестве микробного сьщужного фермента используют фермент, продуцируемый Мцсог т 1 еЬе 1. .Степень дестабилизации сычужного фермента, модифицированного согласно ИЗ 0 бРеТеНИЮ достаточна для удовлет ворения требований, предъявляемых к использованию сыворотки, и не оказывает вредного воздействия на стабильность при хранении препаратов сычужного фермента. .В идеальных условиях фермент может быть ннактивироваи при соответствующей (высокой) температуре таким образом, что остаточная активность фермента уменьшается как функция времени по.экспоненЦиалъно кривой спада,т.е. характеризуется легко определяемымполупериодом долговечности и этот полупериод является функцией температуры (С). Полупериод долговечности Тэд может быть вычислен по формулегде Ад - активность фермента, измеренная ПОСЛЕ нагрева ДО ОП ределенной температуры за время Едактивность фермента, измеренная после нагрева до той же температуры в течение времени 2.При прочих равных условиях полупериод долговечности будет тем короче, чем выше температура. Для многих ферментов изменение рН ферментатив ного раствора и ионной силы, а такжеприсутствие некоторых солейможет существенновлиять на полУПе 0 И 0 д долговечности. Химическая нплнфнкаЦНЯ СПЕЦИФЙЧЕСКОГО ФРРМРНТН ВЫЗЫВЭет термическую дестабилизацию ферМЗНТЗ, ПОЭТОМУ СТЕПЕНЬ ДЕСТЗОИЛИЗВв известной мере приближенные вследствие приблизительного характера зна-10 чения полупериода. Все значения дестабилизации, приведенные в этом опи.сании, измерены при рн 6,0, посколь ку результаты измерений зависят от значения рН. 15Обычно обработка фермента согласно изобретению сопровождается потерей активности. Установлено, что по экономическим причинам дестабилизацию не следует проводить на стадии, 20 соответствующей потере активности в среднем более 50, предпочтительно на стадии при потере 30 ъ 1 более предпочтительно при потере активности мене 10. - й 25Обычно дестабилизацию проводят до уровня 10 С и при потере активностименее 102.Окислитель должен применяться в такой концентрацни,чтобы желаемаяСТЕПЕНЬ ДЕСТЭОИЛИЗЗЦИН ДОСТИГВЛЗСЬ за ПРНЕМЛЕМОЕ ВРЕМЯ, КОТОРОЕ МОЖЕТисчисляться от нескольких минут до 8 ч и более в тек случаях, когда протекает не прерываемая охлаждением реакция. Если концентрация.окислителя слишком мала, то дестабилизация слишком слаба, если же концентрация окислителя очень высокая, то потеря активности слишком велика. Оптимальные концентрации окислителя обьщно соответствуют весовому соотношению между окислителем и общим количеством белка, содержащегося в ферментном препарате, и составляет 3-30 ч. окислителя на 100 ч. общего белка. Если препарат микробного сычужного фермента очищен до высокой степени единич- 55 ной активности, то количество окислителя может быть снижено до 1 г на 100 г общего белка,Значения рн, при которьш протекает реакция, могут варьироваться в широких пределах, т.е. примерно от 3 до 10, что главным образом заивиснт от окислителя. Так, например, если окислителем служит гипохлорит, то предпочтительный предел значений. рН 5-9 и более предпочтительный 6-8.Температура реакции не является критической, если ее поддерживать на определенном уровне, т.е. ниже 3 ОС,когда стабильность фермента удовлетворительная. Однако стабильность фермента может быть повышена добавкойизвестных стабилизирующих белок аген тов, например поваренной соли в количестве 5202 от препаратафермента,или сорбита в обычных для стабилизации ферментов количествах. Сычужный фермент, модифицированный согласно изобретению, способенпроизводить традиционный.детский съю, по своим качествам подобньй сьту Бате и Вапъо и по меньшей мере с такими же свойствами, как и соответствующий немодифицмрованнй сычужны фермент, Операция дестабилизации может н предпочтительно должна-проводитьсякак конечная операция получения микробноно сычужного фермента. рН раствора микробного сычужного фермента,готового для обьщных конечньш операций до введения, устанавливают.на заданном уровне для обработки (например, равным 7)затем сычужный фермент смешивают, перемешивая при комнатной температуре, с раствором окислителя(3-30 ч., например 20 ч. гипохлори та на 100 ч. общего белка). Затемсмесь оставляют на 2-3 ч для достижения желаемого уровня дестабилизад ф ции. Реакцию можно прервать добавкой. активированного угля или восстановид теля, такого как сульфит натрия, ПОСЛЕ завершения СООТВЕТСТВУЮЩЕГОпериода реакции. Дестабилизированный ферментативный продукт подвергают затем обычным конечнъм операциям,те. фильтрации,-установлению рН и единичной ферментативной активности до стандартны уровней и т.д.П р и м е р 1. Исходным материалом служит концентратсычужного фермента (культуральная жидкость концентрируется до активности, примерно соответствующей 12 ному раствору чистого фермента, 182-ный раствор повадренной соли добавляется к сырому кон центрату). Зтотконцентрат носит название Реннилаза-46.В двух сериях пробы, включающих по три порции (25 мл). приготовлен- 5 ныи смешением 12,5 мш реннилазы-46 и 12.5 мл воды. устанавливают рН 7,0,8,0 и 9,0 соответственно добавлением 1 н. На 0 Н и к каждой из этих смесейгипохлорита натрия (ЫаС 10), при этом значения рн сохраняют постоянными на указанном уровне. Первую серию, включающую три порции, помещают в холодильник на ночь 15(приблизительно на 18 ч). Вторую серию, включающую три порции, оставляют при комнатной температуре на 2 ч. Снижение значения рн измеряют попрошествии указанных периодов време 20.ни. Затем порции разбавляют смешением 0,2 мл смеси с 50 мл воды и одновременно устанавливают значение-рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксус ной кислоты. 25 Влияние гипохлорита натрия на ос таточную активность фермента рН при ведено в табл. 1. Затем разбавленные образцы под- вергвют тепловой обработке при 55 С 30 в течение 30 мин при рн 6,0, после чего измеряют остаточную активность.-Влияние тепловой обработки на остаточную активность модифицирован 1 ного гипохлорнтом сьщужного фермента 35Приведено в табл. 2. Влияние тепловой обработки на уро вень дестабилизации фермента, моди-П ри м е р 2. Значение рН трек порций реннилазы-46 по 150 мл в-каждой устанавливают 5,0, 6,0 и 7,0 соответственно. Каждую из трех порций разделяют на три части, к каждой нз которых добавляют 0,8, 1,2 и 1,6 Мл комерческого 2,25 М раствора Ыа 0 С 1 соответственно, при этом рН поддерживают постоянным в указанных выше значениях.дэти девять при комнатнойобразцов хранят затем температуре (22 С) в течение 20 ч, после чего из каждого образца берут пробу (10 мл). К каждой такой пробе добавляют 0,д, 0,6 55 или 0,8 мл 1 М раствора Ыа,5 О, соответственно для удаления избытка гипохлорита, 0,2 мл обработанньщ такимобразом проб разбавляют 50 мл водын устанавливают рН 6,0 смесью уксусной кислоты и ацетата натрия. Разбавленные пробы с установленньт значер нием рН подвергают тепловой.обработ ке при 55 С в течение 30 мин.Результаты дестабилизации сынулного фермента гнлохлорнтон в условияк рН 5,07,0 и с 18-20 С приведены в табл. д.П р и м е р 3. В 600 мл ренинлазы-46 при температуре около 10 с устанавливают значение рн 6,0 4 н. наон. Эту порцию рдзделяют на 6 ч, по 100 мл в каждой. К каждой из этих 6 ч. добавляют 0, 0,8, 1,2,1,6, 2,0 и 2,4 мл коммерческого 2,25 Мраствора На 0 С 1 соответственно н устанавливают-рН 7,0.После выдержки около.15 ч пример-ч но при 5 С добавляют 2 мл 1 Н На,5 О,с целью устранения избыточного гипоКЛ 0 РНТа- добавка сульфита не изменяет стабильности сычужного фермента. измеряют изменение активности. Прот бы по 5 мл разбавляют 10-кратно 0,1 М ацетатным буфером с рн-6,0,после чего разбавленные пробы под ВеВгают тепловой обработке при 60 СОпределяют остаточную активность после тепловой обработки н вычисляют полупериод долговечности и деста билизацию..лом для этого прнмераЦслужит реннела за-46.без 182 НаС 1.На основе указанного исходного материала готовят пять образцов по 200 г с добавкой 0,5 10 15 и 201 НаС 1 соответственно. Устанавливад н. ЫаОН. От каждого из пяти образцов берутпробы по 100 щъ К каждой такой пробе добавляют 1 мл коммерческого2,25 н. На 0 С 1 при 510 С. Затем для всеппяти проб устанавливают рН 7,0 с-помощью 4 н наон и хранят примерПо истечении времени хранения(около 20 ч) определяют изменение активности, Пробы по 5 мл разбавляют 10-кратно 0,1 М ацетатным буфером с рН 6,0, после чего разбавленные про,бы с установившимся значением рН под вергают тепловой обработке при 60 С в течение 15 мн.Определяют остаточную активность ЙЯЮТ На 10 МИН И ЗЗТЕМ добавляют(не подвергнутую тепловой обработке 4 МЛ 1 М РЗСТВОРЗ а 5 Ч, С ЦЕЛЬЮ пробу анализируют параллельно в ка Удаления НЗ 5 ЫТ 0 ЧН 0 Г 0 Хлора честве котродд) 0,2 мл пробы до и после введения Результаты испытаний приведены в 5 хлора разбавляют 50 мл воды и устата 5 д 6 . навливают рН 6,0 смесью ацетатанатд. П р иУм е р 5. Готовят две пор- рия и уксусной кислоты. Потеря ак.сдин смеси 25 мл реннилазы-66 и 20 г тивности связанная с реакцией между ледяной воды, устанавливают рН 7,0 сьщужным ферментом и хлором, составс помощью А н. МаОН. К этим двум пор 0 ляет 21. циям добавляют 33 и 66 мг Ы-хлор- После нагревания обработанного сукцинимида соответственно, растворя- хлором сычужного фермента при 55 С ют в 5 мл ледяной воды, при этом рН в течение 30 мин остаточная активпостоянно поддерживают равным 7,0. ность равна 632, что соответствует Через 2 ч 0,2 мл этих порций раз- 5 полупериоду долговечности около бавляют 50 мл воды, одновременно ус- 45 мин или дестабилизации около 8 С. танавливая рН 6,0 С ПОМОЩЬЮ СМЭСН П р и м е р 8. Готовят две порацетат натрия и уксусной кислоты. ции по 25 мл-реннилазы-46 н 25 г леОстаточная активность после реак дяной воды. Устанавливают рН 7,0 ции сьщужиого фермента с Ы-хлорсук- 20 д н. На 0 Н. цннимндом следующая при использо- . К этим смесям добавляют 60 и вании 33 мг М-хлорсукцинимида 992, 20 мг трихлоризоциануровой кислоты а при использовании - 66 мг - 96,52. соответственно и одновременно уста Проводят тепловую обработку при навливают рН 7,0. . А 55 в течение 30 мин при рН 6,0. 25 Через 4 ч 0,2 мл полученньт смесей после этого определяют остаточную т разбавляют 50 мл воды и одновременно активность и вычисляют полуперноп устанавливают рН 6,0 смесью ацетата долговечности и дестабилизацию. натрия н уксусной кислоты. РазбавленРезультаты приведены в табл. 7. ные пробы подвергают тепловой обра 30 ботке при 55 С в течение 30 мин П р и м е р 6. Готовят раствор Результаты дестабиднзации сЬщужЫа 0 Вх (2 Рчмерно 02 М), добавляя по ого фермента трихлорнзоцнануровой каплям РОМ к Мл ПрЕМЕШНЕЗМОГО кислотой приведены В Табл. В.4 н. На 0 Н при охлаждении вледяной банеъ 525 мл реннилазы-66 смешивают с . 35 25 мл воды и устанавливают рН 7,5 однонормальньт раствором ЫаОН.125 мл полученного раствора в течение часа добавляют 0,5 мл раствора гипобромида натрия, при этом поддерживают рН 7,37,8 добавкой 1 Н. НС 1.Примерно через 30 мин определяют потерю активности и термостабильность. Потеря активности около 20, остаточная активность после тепловой обработки в течение 20 мин при 60 С и рн 6,0 составляет 14, что соответствует полупериоду ДОПГОВЕЧНОСТН около 7 мин или дестабилизации около 8 С.П р н м е р 7. 50 мл реннилазы-46 разбавляют 50 мл воды. Смесь охлаж зы 46 по 25 мл смешивают с 20 г лединой воды для каждой порции и устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. ЫаОН. Затем к каждой из этих порций добавляют 70 и 140 мг хлорамина Т, раство 4 д ренного в 5 мл ледяной воды, соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0. Примерно через 2 ч 0,2 мл каждого образца разбавляют 50 мл воды с одд 5 новременным регулированием значения рН до 6,0 С помощью смеси ацетата натрия и уксусной кислоты Разбавленные пробы с установленным рН подвергают тепловой обработке при 55 С в те чениМинРезультаты дестабилизации фермента хлорамином-Т приведены в табл. 9.дают в ледяной бане и устанавливают П р и м е р 10. Реннилазу-46 без рН 7,0 с помощью 1 н. НаОН. Затем добавки ЫаС 1 3-кратно разбавляют. вводят около 0,1 г свободного хлора, 55 20 мл разбавленной ренннлазы-46 при этом значение рн падает до 3,8, . доводят до рН 8,5 и охлаждают до 0 С,жидкость становится мутной, а затем после чего добавляют 0,7 мл 0,05 М