Способ получения креатинамидиногидролазы

ЕГАРУСЬ ПАТЕНТ не сбйгосудлвствеъ-ньпи комитет по ИЗОБРЕТЕНИЯМ и откгытиям при гкнт СССР а(21) 4355715113 изобретения является повышение стабилита (71) Брингер Маннхайм ГмбХ (ПЕ)(54) споров получения КРЕАТИНАМИДИНОГИДРОЛАЗЫпиидиногидролазы. которая стабильнее. чем нативный фермент. и поэтому более при годна для определения содержания креатинина в сыворотке. плазме или моче. ЦельюИзобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы. которая стабильнее. чем нативный фермент. и поэтому более пригодна для определения содержания креатинина в сыворотке. плазме или моче.Фермент креатинамидиногидролаза ЕС 3.5.3.3 находит промышленное применение для определения креатинина. Его используют для диагноза заболеваний почек. при которых в сыворотке или моче содержание креатинина отклоняется от таковых здорового органиэма. АИзвестны микроорганизмы, которые при индукции засчет креатина в состоянииности фермента. конструируют плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатиНЗМИДИНОГИДРОПЗЗЫ. В КОТОрОМ Произошла аминокисчотная замена в положении 109. а в случае рВТ 119 также в положении 355 замена /а на Мет. Благодаря секвенсироеанию рВТ 119 установлено. что в поло 1063 последовательности в кодирующей нити 6 заменена А/С Ф А/ так. что триплетбТд превращен в АТС. В результате трансформации штаммов-реципиентов полученными ппазмидами созданы штамм Е. со ОЗМ 4105. содержащий плазмиду рВТ 109 и штамм Е. сон ОЗМ 4106. содержащий плазмиду рВТ 119. конститутивно акспрессирующие креатинамидиногидропазу.достаточном для переработки количестве.Однако Достигаемый выход и стоимость . фермента представляют собой лимитирующий фактор для промышленного применения фермента. Известен также способ получения дан. НОГО фермента. при КОТОООМ УДЗПОСЬ ВЫДВлить ген. кодирующий креатинамидиногидролаэу из Рзеиоотопаз рикша. клонировать его рВР 322., После трансформации микроорганизмов вида Е. соП или полученной рекомбинантной ДНК удалось получить конститутиано креатинамидиногидролазу.Этот способ с помощью генной инженерии креатинамидиногидролаэы эффективнее и легче в осуществлении. чем выделение из индуцированного. не содержащего никаКОГШ ПЛЕЗМИДЭ мьткроорганизма.Сднако получаемый с помощью данного способа фермент естественного типа обладает только ограниченътой детергентной и термической стабильностью и. таким образом. оптимально непригоден для использоВЭНИЯ В КЛИНИЧЕСКОМ ТВСТ-СПОСОБЗ.отлттчие от натианого грермента в полщном белке происходит замена аминолоты п полоькегттттч 105. Аминокислота. мн заменяет св валином. Полученный фермент обладает намного лучодей стабильностью. чем натитаный фермент.Стаонструътрогтагь ппазмигды рВТ 109 и рВТ 119. содержащие ген креатинамидиноГНДЭОЛЗЗЫ, В КОТОРОМ ППОИЗОШЛЗ ЭРАИНОКИС лот гня звглена в положениям 109, а а случае рВТ 119 также в положении 355 заменена на ъ Мат. Благодаря секвенсироаапъьтэо рВТПГ нстаноелено, что в положении 1063 последовательности в кодтирующсй нити С замегчтн на А С Ч А). так что триплет ВТБпревращен в АТ . В результате трансфорМЗЦИИ ЦЛТВМРЧОВ ЭВЦИНСНТОЬЧ ПОЛУЧЕННЫМИ отчадчлидатии создданьп штаммы Е. соН. ВЗМ 13105. содержащие плазмиду рВТ 109. и ш атм Е. соН. ОЗМ 4106. содержгцтигл плазмиду рВТ 119. констнтутивно экспрессируудобную для переработки форму в РгепсЬ прессе и креатинамидьтногидролазу очищают путем фракцинирования через молекулярное сито (Софакрип 5 2013) Попученные ферменты инкубируэот при указанных в табл. 3 условиях и затемосуществляют определение фермента при применении тест-комбинации МочевинаТабл. 1 воспроизводит характер стабильности предлагаемых в изобретении мутантов креатинвмидиногидролазы по сравнению с ферментом полученным способом-прототипом при 37 С. причем тестсмесь 1 из тест-комбинации креатинин-РАР (ВМ определение м 839 434) исходная активность 12 /(мп)100.Результаты сравнения констант гмснаепв (Км) при 37 С. 0.1 моль/п ТриоНС. рН 8.0 (оптимальные тест-условия) приведены в табл. 2.Фермент инкубируют при указанных тест-условиях и затем осуществляют определение фермента при тест-комбинациях Мочевина (ВМ определение Мг 124770).Полученный фермент обладает большей стабильностью и с помощью данной креатиНЗМИДИНОГИДРОЛЭЗЫ МОЖНО избежать ПО терь активности фермента при определении КРЗЭТИНИНЭ И ОСУЩВСТВЛЯТЬ надежно ТЭКИВ определения также через более длительныеПВОМВЖУТКИ времени. на ОСНОВЗНИИ УЛУЧщенных свойств также возможно уменьшение количества фермента в креатинин-тесте.Способ получения креатинамидиногидролазн, предусматривающий конструирование рекомбинантной ппаэмидной ДНК. кодирующей креатинамидиногидролазы. трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Езслегсыа соН. культивирование тратасформированного штате-яма. выделение и очистку целевого продукта. о т л и ч а ю щи й с я тем. что. с целью повышения стабильности фермента конструируют рекомби нантную плаэмидную ДНК рВТ 109 или рВТ119. трансформации подвергают штамм Е.соН ВЗМ 4105. или ОЗМ 410 б.при этом плаз-мидой трансформируют штамм Е. соН ОЗМ 4105. а плазмидой рВТ 119 штамм Е. соН 4106.Стабильность полученной креатинамидиногидролаэы по сравнению с известнымКреатинамидиногидролаза из Остатэчная активность. . сп стя. мине. сон иодиоующиизш ВЗМ З 143(рВТ 2 а-1 0501131481) 59 51 39 27 ВЗМ 4105(рВТ 109 ВБМ 4108 Р) 96Определение остеточной активности фермента при оптимальных условиях при различных температурахП р и н е ч а и и е шепнет-чти ннкубнрупт при указанных условиях и затеи осуцествпдт ОПРС деление фермента при применении тестчконбьанацийНочевииа ВН определение 5 13117701.