Способ определения ДНК-азной активности

с 121 ч 9/22 12 в ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 54 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК-АЗНОЙ АКТИВНОСТИСпособ определения ДНК-азной активности,включающий инкубацию содержащего фермент образца с ДНК и введение сгусткообразователя, отличающийся тем, что в качестве сгусткообразователя используют 0,751,25 раствор 2 этокси - бЛ-диаминоакридина (риванол) в концентрации 1 мг/проба, после образования сгустка производят экстракцию из него 2-этоксиг - бд-диаминоакридина 1 н раствором соляной кислоты или смесью. равных(71) Заявитель Витебский медицинский институт (В)(73) Патентообладатели Витебский медицинский институт (ВУ) нобъемов 1 н растворов соляной и серной кислот на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин и по его содержан, определяемому по изменению оптической плотности колометрическимк или фдпоорометрическим способом при длине волны 410 нм, судят о ДНКазной активности.1.Никитин В.М. Справочник экспрессмето дов биохимической индикации микробов-Кишинев, 198 б.-С.146-154 йИзобретение относится к биологии, медтщине,ветеринары, иможет быть использовано для определения ДНК-азной активности в любых биологическудх жидкостях и средах (сыворотка,тканевая хсидкость культурная среда и т.п..Прототипом заявляемого способа послужилОсновной недостаток прототипа полуколичественный характер результатов и невысокая чувствительности Метод не дает возможности точно оцеъштъ велит-ищу образующаяся сгустков,основан на субъективном визуальном учете.Задачей настоящего изобретения является1-4 метод определения ДНК-азной активности по о образованиюсгустка ДНК спиртом обратно пропорционалвно ее деполимеризации. О Данный метод имеет ряд неоспоримых доО стоинств Ф 1) он специфичен 2) величина сгустка пропорциональна количеству и степени расщепления ДНК Ч 3). очень прост в постановке, не требует сиеЩ циально обученного персонала и т.п.повышение чувствительности метода с количественньтм точным определением ДНК-азы. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения ДНК-азной активности,включающим инкубацию содержащего фермент образца с ДНК и введение сгусткообразователя в качестве сгусткообразователя используют 075-1 г,25 раствор З-этокси - 6,9 диаминоакридина (риванол) в концентрации 1 мг/ проба, после образования сгустка произво 3 ВТ 1066 С 1 4дят экстракцию из него 2-этокси - 6,9-дпаминоакридина 1 н раствором соляной кислоты или смесью равных объемов 1 н растворов соляной и серной кислот на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин и по его содержанию, определяемому по изменению оптической плотности колометрическим или флюорометрическнм способом при длине вотшы 410 нм, судят о ДНК-азной активности.Первоначально осуществили подбор оптимальных параметров сгусгкообразования между риванолом и ДНК.Оптимальная концентрация риванола в пробе составляет 0,1 мг (Табл. 1).При постановке обратного эксперпьяента(концентрация риванола постоянна - 0,1 мг/ проба) образование сгустка начинается при содержании ДНК 25 мкг/ мл, линейная зависимость сохраняется с увеличением концент ла в побе мкг. 20 40 100 120 140 160 200рации ДНК до 200 мкт/ мл. Далее весь хромофор потребляется субстратом и увеличения оптической плотности сгустка не происхо дит (Табл. 2).Зависимость между концентрацией ДНК и оптической плотностью риванолового сгусткаТакже была определена зависимость между сгусткообразованием и ионной силой раствора. Используют растворы ЫаС 1 на Трис-НС 1 буфере, молярность которых увеличивается от 0,01 М до 2 М. До кон мкг/мл 25 50 100 150 200 250 300центрации 0,5 М ЫаС 1 оптическая плотность остается неизменной, при дальнейшем нарастании ионной силы раствора она несколько увеличивается (см. Табл. 3).Зависимость сгусткообразования от ионной силы раствораТакже определяется зависимость сгусткообразования от рН среды. Используют следующие буферные растворы с различным рН глицин-НО 0,1 М рН 2,0 2,6 3,35 ацетатный 0,1 М рН 3,6 4,2- готовят 5-кратные разведения фермента ДНК-азы например - панкреатической производства Олайнского завода химреактивов) в диапазоне от 100 нг/мл до 800 пг/ мл на 0,02 М5,3 натрий- фосфатный 0,1 М рН 7,2 8,2 трио-НС 0,02 М рН 7,5. Сгусток не образуется в глицин-НС 1 буфере. При остальных же значениях рН оптическая плотность нарастает пропорционально его увеличению (Табл. 4).Зависимость сгусткообразования от рН среды- к 0,2 мл (1 объем) разведения фермента добавляют 0,2 мл (1 объем) раствора ДНК (300 мг/ мл) и инкубируют в термостате при 37 в течение 60 мин- на поверхность проб наслаивают 20 мкл (1 / 20 от полученного общего объема) 0,5 И, раствора риванола (100 мкг в пробе) и встряхивают для получения сгустка. 1Сгусток однократно отмывают дистиллированной водой, добавляют 0,5 мл 1 н раствора НС 1, образец помещают в кипящую водяную баню на 5 минут для растворения сгустка, после чего смесь доводят до 2,5 мл дистилли- рованной водой и детектируют. Определение проводят. либо фотоэлектроколориметрически(3 светофильтр, толщина рабочего слоя кюветы 0,5 см), либо - спектрофотометрическн(длина волны - 410 нм, толщина слоя - 1 см),либо флюорометрически (длина волны возбуж дения - 410 нм, флюоресценции - 480 нм в случае использования флюориметрасветофильтры с максимумами 365 и 470 нм,соответственно, объем пробдоводят до 5 мл). Измерния проводят против дистиллированной воды или против раствора ринанолаизвестной (125 мкг в пробе) концентрации при флюориметрни.Контролем служит раствор ДНК на буфере.Полученные после детекции величинысравни лают-с предварительно выстроенной калибро вочной кривой по ДНК-аза. с известной активностью, выраженной в международныхКалибровочная кривая для определеъшя активности ДНК-азыПримечание величины оптической плотности представляют собой среднееиз 5 параллель ных определешипй.Коэффициент линейной корреляцгщ между оптической плотностью и содержанием фермента в пробе составил - 0,91 (р 0,01), сила влияния содержания ДНК-азы на оптическую плотность по результатам однофакторного дисперсионного анализа составила 82,6Для научения стабильности окрашивания проб во времени определяют оптическую плотность сразу после добавления хромогена через 30 мин, через 1 ч, 3 ч, б ч, 18 ч, 24 чСтабильность окрашивания проб во времениПримечание среднее по данным трех измеренийКак следует из таблицы, оптическая плотность Е за 3 ч снижается на 0,03 ОД, оставаясь далее постоянной в течение суток. Это создает возможность детекции проб в течение всего рабочего дня.Была произведена оценка воспроизводимости предлагаемого метода (как опытных, так и контрольных проб).К вариации контролей составил 233.Коэффициент вариации ДНК-азной активности внутри одною определения (Табл. 7) оказался равным 7,08 (содержание энзима 10 нг в пробе, верхний участок калибровочной кривой, 9 определений).Определение коэффициента вариации ДНК-азной активности. внутри одного определения (содержание энзима - 10 нг в пробе) 1 т-ольДля определения коэффициента вариации ДНК-авной активности между анализами использовали фермент дезоксирибонуклеазу в концентрации также 10 нг в пробе. Проводилициет вариации опыта был равен 8.86 коэффициент вариации контроля равен 146.Коэффициент вариации ДНК-запой активности между анализами (содержание энзима - 10 нг в пробе)Полученные результаты свидетельствуют о низкой вариашш метода.Была проверена также максимальная чувствительность предлагаемого способа за 30 и 60 мин инкубации. Оказалось, что за 30 мин достоверно открывается до 10 нг энзрпиа. За 1 час - до 2 нг. Когда же инкубация была увеличена до суток, то мы не выявили порога чувствительности способа (он был менее 32 Ш фермента в пробе), хотя контроли при такой инкубации также частично гидролизовались.Было проведено сравнение чувствительности предлагаемого способа со спиртовой методикой и методом вискозиметрии. Наш способ превышает по чувствительности данные методы минимум на 1 порядок.Эффективность способа заключается в том,что он позволяет повысить чувствительность метода по сравнению с прототипом не менее,чем в 10 раз, дает возможность точной количественной оценки содержания фермента(К вариации 10), а также снижает расход субстрата в три раза.Государственное патентное ведомство Республики Беларусь.