Микробиологический способ получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот, микроорганизмы, разлагающие 6-метилникотиновую кислоту и гидроксиазотгетероциклические карбоновые кислоты

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКСИАЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ, МИКРООРГАНИЗМЫ, РАЗЛАГАЮЩИЕ 6-МЕТИЛНИКОТИНОВУЮ КИСЛОТУ И ГИДРОКСИАЗОТГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ(57) 1. Микробиологический способ получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот или их растворимых солей с общей формулой где 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом галогена или 1-4-алкильную группу, а- атом азота или С 3-группу, в котором 3 - атом водорода или атом галогена, отличающийся тем, что азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту или ее растворимые соли с общей формулой где 1, 2 иимеют указанные выше значения, используемую в качестве субстрата, под влиянием содержащих специфическую гидроксилазу и использующих 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмов преобразуют в продукт формулы . 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата применяют азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой где 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом хлора или метильную группу, а- атом азота или -группа. 3961 1 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что проводят реакцию с микроорганизмами, 101, германская коллекция микроорганизмов 6920. 4. Способ по одному или нескольким пп. 1-3, отличающийся тем, что реакцию проводят при однократном или многократном (непрерывном) добавлении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 10 вес. . 5. Способ по одному или нескольким пп. 1-4, отличающийся тем, что реакцию проводят при температуре 15-50 С при рН от 5 до 9. 6. Микроорганизмы 101 (германская коллекция 6920), предназначенные для разложения 6 метилникотиновой кислоты в качестве единственного источника углерода, азота и энергии через 2-гидрокси 6-метилникотиновую кислоту. 7. Гидроксиазотгетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой где- атом азота, 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода,атом галогена или С 1-С 4-алкильную группу, исключая вариант, когда 1 и 2 - водород одновременно, а также в случае, если- -группа, 1 и 2 - атом хлора. 8. 5,6-Дихлор-2-гидроксиникотиновая кислота. 9. 3-Гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота. 10. 3-Гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота. Изобретение относится к области биохимии и микробиологии, в частности к микробиологическим способам получения карбоновых кислот. Под азотсодержащими гетероциклическими карбоновыми кислотами следует понимать гидроксилированные или негидроксилированные кислоты, а также их растворимые соли, такие как, например, соли щелочных металлов или аммониевые соли. 2-гидроксиазотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты представляют собой важнейшие промежуточные продукты в процессах синтеза активных веществ. Например, 2-гидроксиникотиновая кислота служит исходным материалом для получения 2-хлорникотиновой кислоты (пат. заявка США 4 081 451), являющейся, в частности, важным промежуточным продуктом для получения фармацевтических соединений (.. ., 1980, 38(3), стр. 243-252). До настоящего момента не было известно микробиологического метода получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот. Задачей настоящего изобретения была разработка простого и экологически чистого метода получения химически трудно доступных 2-гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот на микробиологической основе. Эта задача решается с помощью микробиологического способа получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот или их растворимых солей с общей формулой где 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом галогена или 1-4-алкильную группу, а- атом азота или С 3-группу, в котором 3 - атом водорода или атом галогена, заключающегося в том, что азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту или ее растворимые соли с общей формулой где 1, 2 иимеют указанные выше значения, используемую в качестве субстрата, под влиянием содержащих специфическую гидроксилазу и использующих 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмов преобразуют в продукт формулы . В другом варианте в качестве субстрата применяют азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой где 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом хлора или метильную группу, а- атом азота или -группа. В предпочтительном варианте проводят реакцию с микроорганизмами, 101, Германская коллекция микроорганизмов 6920. В предпочтительном варианте реакцию проводят при однократном или многократном (непрерывном) добавлении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 10 вес. . В предпочтительном варианте реакцию проводят при температуре 15-50 С при рН от 5 до 9. Другим объектом изобретения являются микроорганизмы 101 (Германская коллекция 6920), предназначенные для разложения 6-метилникотиновой кислоты в качестве единственного источника углерода, азота и энергии через 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту. Еще одним объектом изобретения являются гидроксиазотгетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой где- атом азота, 1 и 2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода,атом галогена или С 1-С 4-алкильную группу, исключая вариант, когда 1 и 2 - водород одновременно, а также в случае, если- -группа, 1 и 2 - атом хлора, в частности 5,6-дихлор-2-гидроксиникотиновая кислота, 3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота, 3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота. Под термином использующие 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмы, содержащие специфическую гидроксилазу следует понимать следующее. Если, например, из шламма отстойника в качестве инокулярной среды при использовании 6 метилникотиновой кислоты вырастить биомассу, то в результате можно получить использующие 6 метилникотиновую кислоту микроорганизмы, т.е. микроорганизмы, способные расти и развиваться с 6 метилникотиновой кислотой как единственным источником углерода, азота и источником энергии. При селекционировании микроорганизмов с использованием известных специалистам методов (речь идет о микроорганизмах, полностью разлагающих 6-метилникотиновуто кислоту через 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту в качестве промежуточного продукта) получаются микроорганизмы, содержащие специфическую гидроксилазу, т.е. микроорганизмы, специфически гидроксилирующие единственный углеродный атом, расположенный между кислотной группой и атомом азота. В принципе для данного метода могут быть использованы все виды микроорганизмов, селекционированные по данному принципу, например, из шлама отстойников или проб почвы. Эти микроорганизмы не описаны в литературе и являются составной частью изобретения. Более целесообразным представляется использование микроорганизмов, известных под названием 101(германская коллекция микроорганизмов), а также их потомства и мутантов. Последние зарегистрированы в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур, ГмбХ, Машеродервег 1 б, Д-3300 Брауншвейг от 10.2.1992. Приведем результаты научно-технических исследований культуры 101 (Германская коллекция микроорганизмов 6920). Форма клеток ничтожно мелкие палочки 3 3961 1 Ширина, мкм 0,4-0,5 Длина, мкм 1,0-1,5 Подвижность Жгутики Грамм-реакция Лизис под действием 3 КОН. Через анализ последовательности 16 -рибонуклеиновой кислоты род определить не удалось. Селекция и культивирование такого типа микроорганизмов при использовании 6-метилникотиновой кислоты производились по известным каждому специалисту методам. В процессе селекции целесообразно проводить скрининг микроорганизмов в аэробных условиях. Во время скрининга микроорганизмы необходимо культивировать в состоянии покоя (не встряхивать). Целесообразно, если количество 6-метилникотиновой кислоты в стадии селекции и выращивания будет составлять до 1 вес. , предпочтительно до 0,5 вес. . Селекцию и выращивание рекомендуется проводить при рН в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8. Температура на стадии селекции и культивирования должна поддерживаться на уровне 15-50 С, предпочтительно от 25 до 40 С. Обычно селекция и культивирование проводятся в среде минеральных солей, предпочтительно в среде минеральных солей, имеющей состав, приведенный в табл. 1. Если делаемая оптическая плотность при 650 нм (ОП 650) составляет от 0,5 до 100, то микроорганизмы либо отбирают с применением известных специалистам методов, либо субстрат, азотсодержащую гетероциклическую кислоту, непосредственно добавляют в среду микроорганизмов для проведения указанной реакции (биотрансформации). Собственно биотрансформация протекает в дальнейшем в соответствии с известными методами при использовании нерастущих клеток. В качестве субстратов с общей формулоймогут быть использованы, например, никотиновая кислота,пиразинкарбоновая кислота или их галоидированные или 1-4-алкилированные производные. В качестве производных никотиновой или паразинкарбоновой кислот предпочтительно использование гидроксилированных 6-хлорникотиновой кислоты,5,6-дихлорникотиновой кислоты и 5 хлорпиразинкарбоновой кислоты. В качестве производных 1-4-пиразинкарбоновой кислоты лучше всего гидроксилируется 5 метилпиразинкарбоновая кислота. Субстрат для биотрансформации можно вводить непрерывно или за один раз. Наиболее целесообразным представляется такое добавление субстрата, чтобы его концентрация в культурной среде не превышала предпочтительно 7 вес. . В качестве среды для биотрансформации можно применять обычные хорошо известные специалисту среды. Процесс биотрансформации предпочтительно проводить в низкомолекулярном фосфатном буфере. Обычно биотрансформацию проводят при использовании суспензии микроорганизмов, имеющих оптическую плотность при 650 нм (ОП 650) в пределах от 0,5 до 100, предпочтительнее от 5 до 50. Биотрансформацию рекомендуется проводить при температуре от 15 до 50 С, предпочтительнее от 25 до 35 С, и рН от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,5. Обычная продолжительность процесса от 5 часов до 3 дней, после чего гидроксилированный продукт,соответствующий формуле 1, выделяется при использовании известных специалистам методов, например путем подкисления не содержащего клеточной культуры верхнего слоя. Полученные по данному методу гидроксиазотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой где- атом азота, 1 и 2 могут иметь одинаковое или различное значение и могут представлять собой атом водорода, атом галогена или С 1-4-алкильную группу, исключая вариант, когда 1 и 2 вместе - водород, а также в случае, если- -группа, 1 и 2 - атом галогена, в литературе не описаны. 3961 1 Наиболее предпочтительными представителями этой новой группы соединений можно считать 5,6 дихлор-2-гидроксиникотиновую кислоту, 3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновуто кислоту и 3-гидрокси-5 хлорпиразинкарбоновую кислоту. Пример 1. Выделение микроорганизмов, использующих 6-метилникотиновую кислоту. В 300-мл колбу Эрленмейера загружали 100 мл среды минеральных солей, содержащей 1 ммоль 6 метилникотиновой кислоты (табл. 1) и добавляли 10 мл шламма из отстойника с очистительных сооружений фирмы Лонца АГ в местечке Весп, Швейцария, или же пробы грунта с предприятий Лонца в Веспе, после чего выдерживали, не оказывая никакого воздействия, при 30 С. Через 10 дней в нескольких загрузках с помощью спектрофотометрического метода определяли 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту. Затем эти культуры повторно прививали несколько раз в свежую среду минеральных солей. После этого в ту же среду вводили путем смазывания образующую 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту клеточную культуру, содержащую 1,6 вес. (об/об) агар-агара. Затем пластинки агара инкубировали при 30 С в атмосфере, содержащей 42 и 962. Отдельные колонии трансферировали в жидкую среду и выдерживали в состоянии покоя. Штамм бактерии, известный под названием 101 (Германская коллекция микроорганизмов 6920), в процессе роста на культуре 6-метилникотиновой кислоты давал 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту. Пример 2. Микробиологическое окисление никотиновой кислоты в 2-гидроксиникотиновую кислоту. Микроорганизмы 101 (ГКМ 6920) выращивались в среде минеральных солей (800 мл) (табл. 1) при добавлении 8 ммолей 6-метилникотиновой кислоты в 1-литровой колбе Фернбаха при 30 С при использовании шейкера 100 об/мин. Инокулят составил 5(об/об). Через 5 дней оптическая плотность достигала около 0,5. Затем клеточную культуру снимали и промывали один раз фосфатным буфером (50-молярным) при рН 7,0. Повторно суспендировали клетки в 20 мл 50 ммоль фосфатного буфера, содержащего 200 мг (1,38 ммолей) натриевой соли никотиновой кислоты. Оптическая плотность (ОП 650) составила 20. Через 6 часов инкубации на шейкере при 30 С методом тонкослойной хроматографии следов никотиновой кислоты обнаружить не удалось. После этого биомассу отделяли на центрифуге, верхний слой подкисляли, доводя рН до 2,5, с целью осаждения 2-гидроксиникотиновой кислоты. С помощью метода 1 Н-ЯМРникаких примесей в выделенном продукте определить не удалось. В общей сложности удалось получить 140 мг (1 ммоль) 2-гидроксиникотиновой кислоты, что соответствовало выходу 72 на введенную никотиновую кислоту. Таблица 1 Растворы среды минеральных солей Раствор 1 по Штоку 24 . 22 156 г 4 10,0 г 24 1,2 г рН с помощью КОН устанавливается на уровне 7,0 Дистиллированная вода 500,0 мл Раствор 2 по Штоку п-аминобензойная кислота 8,0 мг-биотин 2,0 мг Никотиновая кислота 20,0 мг пантотенат 10,0 мг Пиридоксальгидрохлорид 30,0 мг Тиаминдихлорид 20,0 мг Цианокобальамин 10,0 мг Дистиллированная вода 100,0 мл, фильтрованная в стерильных условиях. Раствор 3 по Штоку(37 ) 7,0 мл 242 1,5 г 2 0,07 г 242 0,1 г Н 3 ВО 3 0,006 г 262 0,19 г 272 0,002 г 262 0,024 г 2422 0,036 г Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 С в течение 20 мин 5 0,5 г 2352 0,003 г 24 0,004 г Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 С в течение 20 мин Раствор 5 по Штоку 262 40,0 г 222 5,0 г Дистиллированная вода 200 мл, обработанная в автоклаве при 121 С в течение 20 мин 6-метилникотиновая кислота (500 мМ) Натриевая соль 6-метилникотиновой кислоты 80,0 г Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 С в течение 20 мин Среда для роста 10 ммоль 6-метилникотиновой кислоты раствор 1 25,0 мл 6-метилникотиновая кислота 20,0 мл Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 С в течение 20 мин После стерилизации добавляли раствор 2 0,5 мл раствор 3 1,0 мл раствор 4 1,0 мл раствор 5 0,5 мл Таблица 2 Примеры 3-7 проведены аналогично примеру 2. Результаты приведены в табл. 2. Прим. 3 4 5 6 Исходный материал Натриевая соль 6-хлорникотиновой кислоты Натриевая соль 5,6-дихлорникотиновой кислоты Натриевая соль пиразинкарбоновой кислоты Натриевая соль 5 метилпиразинкарбоновой кислоты(3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота) 1 Н-ЯМР (, 400 мгерц)в частях на миллион 2,4, 2,6, 3,8, 7,8,. 13 С-ЯМР (, 100,5 мгерц)в частях на миллион 20, 40, 130, 134, 155, 164, 170,. Данные анализа к примеру 7(3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота) 1 Н-ЯМР (2 и диоксан, 400 мгерц)в частях на миллион 3,8, 4,7, 8,0,. 13 С-ЯМР (2 и диоксан, 100,5 мгерц)в частях на миллион 132, 133, 145, 149, 164, 172,. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.