Способ экстракции полярных липидов из биомассы бифидобактерий

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ПОЛЯРНЫХ ЛИПИДОВ ИЗ БИОМАССЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ижик Анастасия ВладимировнаНовик Галина ИвановнаЭстера Швайцер Дей(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ экстракции полярных липидов из биомассы бифидобактерий, включающий лиофилизацию предварительно отмытой от компонентов среды культивирования биомассы с последующей экстракцией липидов сверхкритическим диоксидом углерода, модифицированным смесью метанола и воды, взятыми в соотношении 91, при давлении 250 бар,отличающийся тем, что экстракцию проводят при температуре 45 С и скорости потока сверхкритического диоксида углерода, содержащего 10 модификатора, 5-10 г/мин в течение 3-5 ч. Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине, в частности к изоляции биологически активных веществ из клеток пробиотических микроорганизмов, и может найти применение в области производства лечебных и лечебно-профилактических препаратов, приготовлении вакцин, производстве пищевых добавок. Пристальное внимание специалистов к пробиотическим микроорганизмам связано с их особыми свойствами, благодаря которым данные микроорганизмы нашли использование в медицине, пищевой промышленности и ветеринарии. В настоящее время тенденции развития фармакологической отрасли требуют перехода от клеточного уровня к молекулярному, т.е. к использованию вместо клеток микроорганизмов при приготовлении фармакологических препаратов отдельных клеточных компонентов, обладающих биологической активностью. Среди подобных клеточных структур у пробиотических микроорганиз 18306 1 2014.06.30 мов выделяют полярные липиды (глико- и фосфолипиды), обладающие биологической активностью и перспективные для производства на их основе профилактических и лечебно-профилактических препаратов, вакцин, пищевых добавок. Известно множество способов экстракции гликолипидов из клеток пробиотических бактерий с использованием органических растворителей. Среди них метод изоляции гликолипидов из клеток 7469, заключающийся в экстракции бактериальной биомассы метанолом с тремя последующими циклами экстракции в смеси хлороформ-метанол (21). Очистка экстракта проводится методом колоночной хроматографии нас последующим фракционированием на колонке сцеллюлозой 1. Также известен метод изоляции липидов из клеток. Данный метод заключается в четырех последовательных экстракциях биомассы бактерий, которые длятся от 18 до 48 ч. На первой стадии используется смесь хлороформа с метанолом в пропорции 11, на последующих этапах - смесь хлороформ-метанол в пропорции 21. Очистка гликолипидных фракций выполняется последовательно на колонках сцеллюлозой и силикагелем 2. Известен метод выделения гликолипидов из клеток грамм-положительных бактерий,который заключается в трех последовательных экстракциях смесью хлороформ-метанол(21), длящихся 2 ч, с последующей очисткой на колонках с-25 и силикагелем,а также фракционированием на колонке сцеллюлозой 3. Недостатками всех вышеперечисленных методов являются длительность и трудоемкость процедуры экстракции и очистки целевого продукта, использование большого количества органических растворителей, недостаточно высокий выход гликолипидов. Наиболее близким по достигаемому результату является способ экстракции полярных липидов из биомассы пробиотических бактерий в два этапа с использованием сверхкритического оксида углерода 4. Липидный компонент экстрагируют из лиофилизированной биомассы в два этапа 85 С, 250 , скорость потока 2 5 г/мин, 6,3 модификатора в течение 3 ч на первом этапе 40 и 55 С, 250 , скорость потока 2 10 и 15 г/мин, 9,3 модификатора в течение 1,5 ч на втором этапе. В качестве модификатора используют смесь метанол-2 в пропорции 91. Однако данный способ имеет следующие недостатки при данных условиях из клеток бифидобактерий экстрагируются в достаточном количестве только главные гликолипиды, экстракция минорных гликолипидов и фосфолипидов неэффективна температура экстракции на первом этапе (85 С) выше температуры кипения метанола(64,96 С), входящего в состав модификатора, что может приводить к его частичному испарению и, как следствие, к менее эффективной экстракции на втором этапе используется достаточно высокая скорость потока 2 (10 и 15 г/мин), что экономически невыгодно. Задача данного изобретения заключается в разработке нового способа экстракции липидов из клеток бифидобактерий, который отвечает требованиям эргономичности, требует меньших затрат 2, а также является пригодным для экстракции как гликолипидов,так и фосфолипидов. Поставленная задача решается за счет изменения следующих режимов экстракции температура 45 С, скорость потока 2 5 и 10 г/мин, экстракция проводится в один этап. Предложенный нами способ является современной альтернативой способам выделения полярных липидов, причем он является эффективным для экстракции как гликолипидов, так и фосфолипидов. Бактериальную биомассу трижды отмывают от среды культивирования в буфере и 2 и лиофилизируют. Экстракцию липидов из высушенной биомассы проводят с использованием -2100 системы (., , США) с использованием сверхкритического диоксида углерода. В качестве модификатора применяют смесь метанол-2 в пропорции 91. Продолжительность экстракции составляет от 2 до 9 ч. По 2 18306 1 2014.06.30 лученные экстракты упаривают в роторном испарителе для удаления модификатора, собранные фракции высушивают в эксикаторе и под струей азота. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. Экстракция полярных липидов из биомассы клеток. Экстракцию полярных липидов из .проводят при следующих условиях температура 45 С, давление 250 , скорость потока 2 10 г/мин фракции собирали через 2 ч. Для увеличения полярности сверхкритического оксида углерода используют органические растворители и их смеси с водой. Результаты экстракции липидов из .представлены в табл. 1. СФЭпредставляет собой повторение эксперимента, описанного в прототипе, то есть экстракцию проводили в два этапа, последовательно применяя разные параметры экстракции 85 С, 250 , скорость потока 2 5 г/мин, 6,3 модификатора в течение 3 ч на первом этапе 40 и 55 С, 250 , скорость потока 2 10 и 15 г/мин, 9,3 модификатора в течение 1,5 ч на втором этапе. Выход липидов из 1 г биомассы был невысоким, в основном экстракты содержали гликолипиды. Для улучшения контакта между растворителем и клетками бактерий скорость потока 2 снижают с 10 до 5 г/мин, температуру - до 45 С, содержание модификатора оставалось неизменным и составляло 10 , экстракцию проводят в один этап без изменения режима. Результатом стал более высокий выход липидов (в 2 раза выше) по сравнению с прототипом. В целом максимальный выход полярных липидов наблюдался между 3 и 6 часами экстракции. Оптимальные условия экстракции (СФЭ , табл. 1) применяют для длительного фракционированного извлечения липидов из 5 г сухой биомассы (СФЭ , табл. 1 фиг. 1). Наиболее эффективной экстракция липидов являлась на 3-4 ч, максимальный выход гликолипидов (фиг. 1) наблюдался в течение 3-5 ч фосфолипиды наиболее эффективно экстрагировались после 5 ч экстракции (фиг. 1). В табл. 1 указаны результаты экстракции полярных липидов из биомассы . . СФЭэтап 1 - скорость потока 2 10 г/мин, метанол как модификатор (10 ) этап 2 скорость потока 2 10 г/мин, метанолвода (91) как модификатор (10 ). СФЭскорость потока 2 10 г/мин, ацетон как модификатор (10 ). СФЭ 85 С, 250 , скорость потока 2 25 г/мин, 6,3 модификатора в течение 3 ч на первом этапе 40 и 55 С,250 , скорость потока 2 10 и 15 г/мин, 9,3 модификатора в течение 1,5 ч на втором этапе. СФЭскорость потока 2 5 г/мин, метанолвода (91) как модификатор (10 ),1 г лиофилизированной биомассы. СФЭусловия, аналогичные СФЭ , 5 г лиофилизированной биомассы. Фракции собирали каждые 2 ч. Температура 45 С (кроме СФЭ ),давление 250 . Таблица 1 Углеводы,Фосфор,Общий Тип эксЛипид,Общие углемкг/мг ли-мкг/мг липи-фосфор,тракции мг воды, мкг пида да мкг СФЭэтап 1 3,57 21,41 0,31 76,43 16,02 0,15 57,19 этап 2 17,32 26,04 0,27 451,01 16,37 0,17 283,53 СФЭфракция 1 4,08 16,03 0,22 65,40 фракция 2 3,27 12,04 0,21 39,37 СФЭ Как видно из табл. 1, результаты экстракции полярных липидов из биомассы .зависят от выбранных условий и являются наилучшими при использовании следующего режима экстракция в один этап, смесь метанолвода (91) (10 ) в качестве модификатора, скорость потока СО 2 5 г/мин (СФЭ ), температура 45 С, давление 250 . Пример 2. Экстракция полярных липидов из биомассы клеток. Наиболее эффективные условия экстракции, подобранные для В. , применяют для изоляции полярных липидов из биомассы В.(скорость потока 2 5 г/мин,метанолвода 91 (10 ) в качестве модификатора, температура 45 С, давление 250 ,экстракция в один этап). Экстракцию проводят из 1 или 5 г лиофилизированной биомассы(СФЭи , табл. 2). Массы липидов, выделенных из 1 г .и . , между собой значительно не отличались. В среднем экстракты липидов .содержали меньше углеводов и фосфора в 1 мг липидного экстракта по сравнению с . . При изоляции липидов из 5 г биомассы .наблюдалось равномерное распределение выхода липидов на протяжении всей экстракции (12 ч), в то время как максимальный выход липидов из .был отмечен на 3-4 ч экстракции (фиг. 1). В табл. 2 указаны результаты экстракции полярных липидов из биомассы . . Условия аналогичны СФЭи СФЭСФЭ- 1 г лиофилизированной биомассы,СФЭ- 5 г. Таблица 2 Углеводы,Фосфор,Тип экстракОбщийОбщие угЛипид, мг мкг/мг лимкг/мг ли-ции фосфор, мкг леводы, мкг пида пида СФЭфракция 1 10,08 18,56 0,23 187,08 9,07 0,19 91,43 фракция 2 13,26 22,13 0,21 293,44 15,48 0,21 205,26 фракция 3 16,82 23,07 0,21 388,04 12,26 0,21 206,21 фракция 4 14,16 22,75 0,23 322,14 12,37 0,23 175,16 СФЭфракция 1 13,21 20,07 0,21 265,12 14,05 0,22 185,60 фракция 2 27,37 23,17 0,25 634,16 12,18 0,21 329,81 фракция 3 26,08 21,35 0,19 556,81 12,09 0,23 315,31 фракция 4 28,93 22,16 0,22 641,09 12,97 0,23 375,22 фракция 5 30,05 21,13 0,22 634,96 14,18 0,25 426,11 фракция 6 19,22 20,02 0,19 384,78 13,35 0,21 256,59- стандартное отклонение. 4 18306 1 2014.06.30 Пример 3. Анализ липидных профилей .и . . Полученные липидные экстракты анализируют с помощью метода тонкослойной хроматографии. Липидный профиль В.характеризуется наличием четырех гликолипидов - два главных (1, 2) и два минорных (11, 12) (фиг. 2 А). Более широкий спектр гликолипидов был выделен из В.(табл. 2, СФЭ ) - четыре главных и три минорных гликолипида (фиг. 2 Б). По сравнению с прототипом было выделено большее количество фосфолипидов из .(табл. 1, СФЭфиг. 2 А, линия 2-4) и из.практически не отличались между собой. Далее были проанализированы более подробно гликолипиды и фосфолипиды, выделенные с использованием 2 при различных условиях. При скорости потока 2 10 г/мин из .изолировали только два основных гликолипида (фиг. 3 А), после снижения скорости потока до 5 г/мин отмечался более высокий выход главных гликолипидов, также были выделены минорные гликолипиды (фиг. 3 Б). При пролонгированной экстракции из 5 г биомассы в первые 6 ч были изолированы все четыре гликолипида из . , после 7-8 ч были изолированы один главный и один минорный гликолипиды, после 9-10 ч экстракт в основном содержал один из минорных гликолипидов (фиг. 3 Б). После 5-8 ч экстракции из 5 г (фиг. 3 Д, линии 3, 4) отмечался более высокий выход гликолипида, который ранее упоминался нами как минорный (11, фиг. 2 Б). Уровни общего фосфора были в 2-3 раза выше по сравнению с прототипом в экстрактах, собранных на 3-4 ч экстракции из 1 г и на с 3-6 ч экстракции из 5 г биомассы .(табл. 1 фиг. 4 А, линии 7, 11, 12), и в экстрактах, собранных с 3 по 10 ч при экстракции из 5 г биомассы .(табл. 2 фиг. 4 Б, линии 7-10). Согласно полученным данным, предлагаемый способ изоляции полярных липидов превосходит ранее предложенный способ, состоящий из двух этапов с различными режимами (прототип). Преимущества предлагаемого метода по сравнению с прототипом заключаются в следующем 1. Предлагаемый способ обеспечивает более высокий выход (в 2 раза больше по массе) и чистоту конечного продукта - полярных липидов. Способ позволяет эффективно изолировать минорные гликолипиды и фосфолипиды в достаточном для анализа количестве. 2. Снижение температуры экстракции с 85 до 45 С позволяет повысить эффективность экстракции за счет исключения возможности испарения модификатора. 3. Экстракция проводится в один этап, также снижен расход углекислого газа для экстракции, что делает способ более эргономичным, менее трудоемким и применимым для масштабов промышленного производства. Источники информации 1..,.,. 7469 //. - 1968. - . 107. - . 4. - . 491-496. 2..,// . . . - 1968. - . 243. - 23. - . 6196-6201. 3.,.,..//. - 1966. - . 99. - . 3. - . 546-549. 4. Патент Республики Беларусь 13271 (прототип). Фиг. 1 Результаты пролонгированной экстракции липидов из биомассы .и . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8