Способ экстракции полярных липидов из биомассы пробиотических бактерий

развития фармакологической отрасли требуют перехода от клеточного уровня к молекулярному, т.е. к использованию вместо клеток микроорганизмов при приготовлении фармакологических препаратов отдельных клеточных компонентов, обладающих биологической активностью. Среди подобных клеточных структур у пробиотических микроорганизмов выделяют полярные липиды (глико- и фосфолипиды), обладающие биологической активностью и перспективные для производства на их основе профилактических и лечебно-профилактических препаратов, вакцин, пищевых добавок.Известно множество способов экстракции гликолипидов из клеток пробиотических бактерий с использованием органических растворителей. Среди них метод изоляции гликолипидов из клеток ЬасгоЬасйПиз сазет А.Т.С.С. 7469, заключающийся в экстракции бактериальной биомассы метанолом с тремя последующими циклами экстракции в смеси хлороформ-метанол (221). Очистка экстракта проводится методом колоночной хроматографии на Зерпабех О с последующим фракционированием на колонке с ВЕАЕ целлюлозой 1.Также известен метод изоляции липидов из клеток РгортопйЬасгегйиш зпегшапй. Данный метод заключается в четырех последовательных экстракциях биомассы бактерий, которые длятся от 18 до 48 часов. На первой стадии используется смесь хлороформа с метанолом в пропорции 11, на последующих этапах - смесь хлороформ-метанол в пропорции 21. Очистка гликолипиднь 1 х фракций выполняется последовательно на колонках с ВЕАЕ целлюлозой и силикагелем 2.Известен метод выделения гликолипидов из клеток грамм-положительных бактерий,который заключается в трех последовательных экстракциях смесью хлороформ-метанол(221), длящихся два часа, с последующей очисткой на колонках с 5 ер 11 абех 6-25 и силикагелем, а также фракционированием на колонке с ВЕАЕ целлюлозой 3.Недостатками всех вышеперечисленных методов являются длительность и трудоемкость процедуры экстракции и очистки целевого продукта, использование больщого количества органических растворителей, недостаточно высокий выход гликолипидов.Наиболее близким по достигаемому результату является способ экстракции полярных липидов из клеток бифидобактерий с использованием смеси хлороформ-метанол 4, 5. Липидный компонент экстрагируют из отмытой биомассы трижды в пропорции 15-30 мл смеси на 1 г сырой биомассы в течение 18-24 часов при 37 С при постоянном перемешивании. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе при 40-45 С. Гликолипиды отделяют от фосфо- и нейтральных липидов на колонке с активированным силикагелем, последовательно элюируя их хлороформом (для нейтральных липидов), ацетоном (для гликолипидов) и метанолом (для фосфолипидов). Полученный пул гликолипидов фракционируют также на колонке с силикагелем, в качестве элюента используя градиент метанола в хлороформе - 0 , 5 , 10 , 15 , 20 , 30 , 50 , 100 . Данный способ однако имеет существенные недостаткинизкий выход конечного продукта, что обусловлено недостаточной экстрагирующей силой органических растворителей по отнощению к полярным липидам, а также потерями при манипуляциях по выпариванию экстрактов, очистке и фракционированию гликолипидовиспользование токсических органических материалов и генерация больщого количества отходов, что делает способ экологически вреднымнеобходимость дополнительной очистки полярных липидов от содержащихся в экстрактах нейтральных липидов.Задача данного изобретения заключается в разработке нового метода экстракции гликолипидов из клеток пробиотических бактерий, который отвечает требованиям экологичности, эргономичности, требовал бы меньщих временных затрат, а также давал более высокий выход конечного продукта.Поставленная задача решается за счет использования в качестве растворителя суперкритического углекислого газа с добавлением смеси метанол-вода (91) в качестве модификатора. Предложенный нами метод является современной альтернативой классическим методам выделения полярных липидов. Использование смеси метанола с водой в качестве модификатора является новым решением и применено впервые для изоляции полярных липидов у пробиотических микроорганизмов.Бактериальную биомассу несколько раз отмывают от среды культивирования в буфере и МПА О Н 2 О и лиофилизируют. Экстракцию гликолипидов из высушенной биомассы проводят с использованием 5 РЕ-2 Х 100 Р системы (Т 11 аг Тес 1 шо 1 о 3 у 1110., РшзЬигп, США) с использованием сверхкритического диоксида углерода. В качестве модификатора применяют смесь метанол-Н 2 О в пропорции 91. Полученные экстракты упаривают в роторном испарителе для удаления модификатора, собранные фракции высушивают в эксикаторе и под струей азота.Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами.Экстракция гликолипидов из биомассы клеток бифидобактерий с использованием сверхкритического диоксида углерода.Биомассу, полученную при культивировании бифидобактерий в модифицированном бульоне МСБ, отмывают от компонентов среды фосфатным буфером (рН 7,3) и Н 2 О МПА О и лиофилизируют. Фракционирование биомассы и экстракцию липидов и гликолипидов выполняют с помошью 5 РЕ-2 Х 100 Р системы (Т 11 аг Тес 11 по 1 о 3 у 1110., РЙЗЬПГЙ, США) с использованием сверхкритического диоксида углерода (5 сСО 2). В работе используют следуюшие эксплуатационные режимы давление - 30 МПа, скорость потока СО 2 - 5 г/мин,температура - 40 С. В качестве модификаторов 5 сСО 2 используют ряд органических растворителей, перечень и концентрации которых приведены ниже при описании результатов(табл. 1). Процедуру выполняют в два этапа первый статический (-30 мин) - для разрушения клеточных стенок бифидобактерий второй динамический -120 мин, состояший из двух стадий по - 60 мин, предназначен для экстракции липидов и гликолипидов (фракции 1 и П соответственно). Первую фракцию отбирают через 60 мин от начала динамического этапа, вторую - через 120 мин. Модификаторы из опытных образцов удаляют на вакуумном роторном испарителе при 55 С, собранные фракции высушивали под струей азота и в эксикаторе, затем взвешивали на аналитических весах и анализировали с помошью ТСХ.В табл. 1 и на фиг. 1 представлены данные об экстракции гликолипидов из клеток бифидобактерий с применением сверхкритического диоксида углерода.При использовании в качестве модификаторов чистых этанола и метанола наблюдается эффективная экстракция нейтральных липидов (фиг. 1 А, 6-10), а в случае применения смесей спиртов с водой - гликолипидов (фиг. 1 В, 1-4). Наиболее высокая эффективность экстракции и степень чистоты образцов гликолипидов достигалась в случае использования в качестве модифицирующей смеси метанола и воды в пропорции 91 по объему.Сравнение профиля гликолипидных фракций, а также их биологической активности,экстрагируемых с помощью сверхкритического диоксида углерода и органических растворителей.Из биомассы бифидобактерий изолируются липиды согласно классическому методу экстракции с использованием органических растворителей. Полученный материал подвергается фракционированию на колонке 1 (5111 са 3 е 1 60, 70-230 ше 511), и выделяется ацетоновая фракция, содержащая гликолипиды. Данная фракция подвергается препаративной хроматографии на колонке П (5111 са 3 е 1 60, 200-300 ше 511), в результате чего от общего пула гликолипидов отделяются главные гликолипидные фракции (фракция П-5 Мет). В экспериментах с использованием сверхкритической флюидной технологии экстракт липидов и фракция П-5 Мет были использованы в качестве контрольных образцов. Для оценки эффективности сверхкритической флюидной технологии получения полярных липидов из биомассы бифидобактерий выполняется исследование полученных экстрактов методом ТСХ, а также определение уровня серологической реактивности экстрагированных модифицированным 5 сСО 2 гликолипидов.На фиг. 2 представлены результаты ТСХ-анализа гликолипидных фракций, полученных с помощью многоступенчатой очистки органическими растворителями и экстракцией модифицированным 5 сСО 2 при температурах 40 и 55 С. Модификатор - метанол-Н 2 О в пропорции 91. Сравнительный ТСХ-анализ фракций гликолипидов, полученных с помощью классического метода и экстракцией модифицированным 5 сСО 2, показал присутствие и идентичность главных гликолипидов во всех полученных опытных образцах.На фиг. 3 представлены данные, полученные при определении уровня серологической активности экстрагируемых гликолипидов. Определение содержания специфических антител в поликлональной сыворотке крови анти-вййбоЬасгегйиш методом ЕЫБА выявило более высокий уровень антител к гликолипидам, изолированным 5 сСО 2 в сравнении с контрольным образцом (П-5 Мет). Серологическая реактивность главных гликолипидов(фракция П-5 сСО 2 55 С), полученных с использованием сверхкритической флюидной технологии, была на 50 выще в сравнении с контролем. Это свидетельствует о сохранении химической структуры молекулы антигена при использовании экстракции гликолипидов модифицированным 5 сСО 2.Экстракция гликолипидов и фосфолипидов из биомассы молочнокислых бактерий рода ЬасгоЬасйПиз с использованием сверхкритического диоксида углерода и смеси метанолН 2 О в качестве модификатора.Микроорганизмы культивируют в МРС среде при 37 С, биомассу отмывают в фосфатном буфере, дистиллированной воде и лиофилизируют. Из сухой биомассы экстрагируют полярные липиды с помощью 5 РЕ-2 Х 100 Р системы (Т 11 аг Тес 1 шо 1 о 3 у 1110., РшзЬигп,США) с использованием сверхкритического диоксида углерода (5 сСО 2). Экстракцию проводят в два этапа на первом этапе биомассы удаляют нейтральные липиды, на втором проводят экстракцию полярных липидов. Для рещения данных задач на разных этапах последовательно применяют разные параметры экстракции 85 С, 250 Ьаг, скорость потока СО 5 г/мин, 6,3 модификатора в течение 3 часов на первом этапе 40 и 55 С, 250 Ьаг,скорость потока СО 10 и 15 г/мин, 9,3 модификатора в течение 1,5 часов на втором этапе. В качестве модификатора используют смесь метанол-Н 2 О в пропорции 91. Экстракты упаривают на роторном испарителе для удаления модификатора, высушивают в эксикаторе. В качестве контроля используют липидный экстракт, полученный из идентичного количества биомассы с помощью органических растворителей.Полученные липидные фракции анализируют методом тонкослойной хроматографии. Для полуколичественного определения глико- и фосфолипидов измеряют содержание углеводов и фосфора в экстрактах.В табл. 2 приведены данные по содержанию глико- И фосфолипидов во фракциях, полученных при экстракции липидов модифицированным сверхкритическим диоксидом углерода в сравнении с органическими растворителями. Из результатов видно, что сочетание температуры 55 С и скорости подачи СО 15 г/м позволяет достичь 10 кратного увеличения выхода гликолипидов и 7-кратного увеличения выхода фосфолипидов по сравнению с классическими методами экстракции.Таблица 2 Количество Общее Ко КОЛИЧ уг- Общее коли- Колич. фосфора Экстракция / личество леводов на липидов чество фосфо- на 1 мг экстракта условия (ЮЗ) углеводов 1 мг экс- ра (Н) (Ю 018) тракта 018) Этап 1 30,3 360,57 11,9 1 1,3 не обнаружено не обнаружено 1 Этап 2 (55 С, 26,1 1315,44 50,4 1 0,2 389,16 14,91 1 4,78 15 /шш ) Этап 2 11 259,60 23,6 1 0,3 35,18 3,20 1 0,18 Этап 2 (40 С, 13,6 750,72 55,2 1 1,8 202,13 14,86 1 0,61 10 /шш ) Этап 3 7,8 215,28 27,6 1 0,4 41,40 5,31 1 0,07 Этап 2 (40 С, 6,3 288,54 45,8 1 0,4 92,75 14,72 1 1,33 15 /шш ) Экстракция 15,2 124,80 8,0 1 3,3 53,77 3,45 1 0,58 органическими растворителямиАнализ экстрактов методом тонкослойной хроматографии выявил наличие большого количества фосфо- и гликолипидов в материале, полученном на второй стадии экстракции, а также их следовое количество в липидном экстракте, полученном на стадии предварительной обработки бактериальной биомассы (фиг. 4). Кроме того, ТСХ-анализ показал идентичность гликолипидных фракций, получаемых при экстракции сверхкритическим СО и органическими растворителями, что свидетельствует о том, что процесс сверхкритической флюидной экстракции не оказывает воздействия на химическую структуру экстрагируемых компонентов.Исследование влияния изолированных методом суперкритической флюидной экстракции гликолипидного (А) и фосфолипидного (В) компонентов из клеток ЬасгоЬасйПиз на активность роста молочнокислых и бифидобактерий.Липидные компоненты (1 мкг/50 мкл метанола) помеЩают в ячейки полистирольных планшетов и оставляют на 4 ч при 24 С для полного испарения метанола. Лунки наполняют стерильной средой МРС и засевают указанными культурами пробиотических бактерий. В качестве посевного материала используют физиологически активные (111 генерация) культуры бактерий. Об активности роста микроорганизмов в присутствии липидных компонентов судят по результатам измерения оптической плотности культуральной жидкости после 24 и 96 ч культивирования при 37 С.В табл. 3 представлены данные по накоплению биомассы культурами пробиотических бактерий в присутствии гликолипидов и фосфолипидов, выделенных из клеток ЬасгоЬасшиз.