Способ выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕМОЗОЛОМИДА ИЗ ЕГО СОЛЬВАТА С ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ(73) Патентообладатели Учреждение Бело(22) 2010.09.22 русского государственного универси(43) 2012.04.30 тета Научно-исследовательский инс(71) Заявители Учреждение Белорусского титут физико-химических проблем государственного университета НаучноБелорусский государственный униисследовательский институт физиковерситетхимических проблем Белорусский (56)2007/0225496 1. государственный университет 5260291 , 1993.(72) Авторы Матюшенков Евгений Александрович Козырьков Юрий Юрьевич Юркштович Татьяна Лукинична Бычковский Павел Михайлович Беляев Сергей Александрович(57) Способ выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом, при котором сольват темозоломида с диметилсульфоксидом кипятят с сухим ацетоном или смесью ацетона и воды при содержании воды 0,1-15,0 объемных процентов при перемешивании в течение 0,5-3,0 часов, фильтруют и сушат. Изобретение относится к органической химии, в частности к химии гетероциклических фармакологически активных соединений, конкретно к 4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8 пентазабицикло 4,3,0 нона-2,7,9-триен-9-карбоксамиду (темозоломиду). Темозоломид - гетероциклическое соединение из ряда имидазотетразинов, обладающее противоопухолевой активностью и применяющееся для лечения злокачественных глиом, меланом и других форм злокачественных опухолей 1. Темозоломид - бесцветное кристаллическое вещество, малорастворимое в воде, умеренно растворимое в диметилсульфоксиде. Темозоломид устойчив в кислой среде (5) и лабилен в основной (7),поэтому может применяться перорально. При физиологичесих значенияхтемозоломид спонтанно гидролизуется в 5-(3-метилтриазен-1-ил)имидазол-4-карбоксамиди затем фрагментируется в 5-аминоимидазол-4-карбоксамид и катион метилдиазония, который является метилирующим агентом в отношении молекул ДНК 2-4. Удобным методом получения темозоломида является циклоприсоединение метилизоцианата к 5(4)-диазоимидазол-4(5)-карбоксамиду, доступному из 5(4)-аминоимидазол-4(5)-карбоксамида 5-7. Реакцию проводят в среде диметилсульфоксида (ДМСО), и для применения в качестве лекарственного средства выделяемый продукт требует дополнительной очистки. Так, при воспроизведении описанной методики нами было обнаружено, что выделяемый темозоломид представляет собой сольват с ДМСО с мольным соотношением темозоломидДМСО 11,в то время как в медицинской практике используется не содержащий ДМСО темозоломид. Прототипом изобретения является метод очистки темозоломида, описанный в патенте 6. Авторы очищали темозоломид, полученный реакцией 5(4)-диазоимидазол-4(5)карбоксамида с метилизоцианатом в среде ДМСО, промывкой водным ацетоном. Метод состоит в добавлении к неочищенному темозоломиду ацетона при 27 С и перемешивании суспензии в течение 30 мин, последующем охлаждении суспензии до 0 С, добавлении воды и перемешивании в течение 30 мин. После фильтрования кристаллов их снова суспендировали в ацетоне и перемешивали при 0 С в течение 1 ч, затем фильтровали, снова суспендировали в ацетоне и перемешивали при 25-30 С в течение 1 ч, затем фильтровали,промывали на фильтре ацетоном и сушили при 60 С в вакууме. Всего на 2 кг темозоломида авторы расходовали 13 л ацетона и 4 л воды. Недостатком данного метода является большое количество операций. Задачей настоящего изобретения является разработка улучшенной методики выделения темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом. Поставленная задача решается тем, что выделение темозоломида из его сольвата с диметилсульфоксидом проводят кипячением при перемешивании с сухим или водным ацетоном в течение 0,5-3 часов с последующими фильтрованием и сушкой при этом получается мелкокристаллический темозоломид. Изобретение иллюстрируют фигуры, таблицы, примеры. Фиг. 1 - спектры ЯМР 1 (400 МГц, 2) в области 0-10 м.д. стандартного образца темозоломида от(вверху) и после промывки сольвата темозоломида с ДМСО сухим ацетоном при кипячении в течение 1 часа (внизу). Фиг. 2 - спектры ЯМР 1 (400 МГц, 2) в области 2,5-4,4 м.д. темозоломида после промывки его сольвата с ДМСО сухим ацетоном при кипячении в течение 1 часа (вверху) и исходного сольвата темозоломида с ДМСО (внизу). Фиг. 3 - ИК-спектры стандартного образца темозоломида от(вверху) и после промывки его сольвата с ДМСО сухим ацетоном при кипячении в течение 1 часа (внизу). Фиг. 4 - микрофотографии образца темозоломида, полученного кипячением его сольвата с ДМСО в сухом ацетоне в течение 1 часа. Пример 1 Очистка темозоломида кипячением в сухом ацетоне. В круглодонной колбе емкостью 250 мл, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, кипятят при перемешивании смесь 15,55 г сольвата темозоломида с ДМСО и 155 мл ацетона в течение 1 часа. Затем суспензию охлаждают до комнатной температуры, фильтруют на стеклянном фильтре с пористой стеклянной пластиной (фильтр Шотта) и размером пор 100 (3) в вакууме водоструйного насоса. Продукт сушат на фильтре продуванием воздуха с помощью водоструйного насоса в течение 1 ч, затем переносят в круглодонную колбу и сушат в течение 30 мин при остаточном давлении 2-4 мм рт. ст. Получается 10,75 г темозоломида в виде белого мелкокристаллического порошка. Выход 96-99(в расчете на содержание темозоломида в сольвате 69-72 ). Анализ опытных серий полученного темозоломида с помощью ВЭЖХ дал чистоту полученного образца (100,92,2)относительно стандартного образца от компаниис заявленным содержанием темозоломида не менее 98 . Спектр ЯМР 1 (2, 400 МГц), , м.д. 4,01 с (3), 8,65 с (1). Спектр ЯМР 1 (ДМСО-6, 400 МГц), , м.д. 3,83 с (3), 8,59 с 2(1), 7,55 с (1), 7,87 с (1). ИК (таблетка , см-1) 3422, 3389, 3188, 3114, 1758, 1759,1733, 1679, 1601, 1453, 1403, 1355, 1266, 1218, 1043, 949, 737, 731, 711, 634, 568, 513. Примеры 2-11 Очистка темозоломида кипячением в сухом или водном ацетоне. В круглодонную колбу емкостью 25 мл, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, помещают навеску очищаемого образца темозоломида (экспериментальные подробности описаны в табл. 1) и на единицу массы образца добавляют десятикратное по объему количество растворителя. Полученную суспензию кипятят в течение определенного времени (0,5-3 часа), затем дают самопроизвольно охладиться до комнатной температуры и фильтруют на стеклянном фильтре с пористой стеклянной пластиной(фильтр Шотта) и размером пор 100 (3) в вакууме водоструйного насоса. Продукт сушат на фильтре продуванием воздуха с помощью водоструйного насоса в течение 1 ч, затем переносят в круглодонную колбу и сушат в течение 30 мин при остаточном давлении 2-4 мм рт. ст. Содержание темозоломида в полученных образцах анализируют методом ВЭЖХ относительно стандартного образца от компаниис заявленным содержанием темозоломида на менее 98 . Массы, содержание темозоломида и внешний вид образцов и раствора приведены в табл. 1. Таблица 1 Условия очистки темозоломида кипячением в водном ацетоне Масса (г) и обоОбозначе- Масса Содержа значение вве- Усло- ние полу- получен- Внешний вид кристал- ние темоприденного в вия ченного ного облов и раствора золомида,мера очистку образца образца разца, г белый порошок,2 0,50 (А) 1 А 1 0,34 92,10 бесцветный раствор белый порошок,3 0,50 (А) 2 А 2 0,35 99,99 бесцветный раствор белый порошок,4 0,33 (А 2) 2 А 3 0,30 99,35 бесцветный раствор белый порошок,5 0,28 (3) 2 А 4 0,24 99,19 бесцветный раствор белый порошок, чуть 6 0,50 (А) 3 А 5 0,34 98,73 желтоватый раствор белый порошок, чуть 7 0,32 (А 5) 3 А 6 0,27 103,03 желтоватый раствор белый порошок, чуть 8 0,25 (А 6) 3 А 7 0,23 97,33 желтоватый раствор белый порошок,9 0,50 (А) 4 А 8 0,33 100,61 желтоватый раствор белый порошок,10 0,31 (А 8) 4 А 9 0,28 100,04 желтоватый раствор белый порошок,11 0,26 (А 9) 4 А 10 0,21 не опред. желтоватый раствор А - сольват темозоломида с ДМСО. Условия проведения очистки 1 - кипячение с сухим ацетоном при перемешивании в течение 3 часов 2 - кипячение с сухим ацетоном при перемешивании в течение 1 часа 3 - кипячение с водным ацетоном (5 воды по объему) при перемешивании в течение 1 часа 4 - кипячение с водным ацетоном (10 воды по объему) при перемешивании в течение 1 часа.По данным анализа с помощью ВЭЖХ. 3 15961 1 2012.06.30 Примеры 12-17 Оценка воспроизводимости очистки темозоломида кипячением в водном ацетоне. В круглодонную колбу емкостью 25 мл, снабженную магнитной мешалкой и обратным холодильником, помещают 0,50 г очищаемого образца темозоломида и добавляют 5 мл сухого ацетона. Полученную суспензию кипятят в течение 1 ч, затем дают самопроизвольно охладиться до комнатной температуры и фильтруют на стеклянном фильтре с пористой стеклянной пластиной (фильтр Шотта) и размером пор 100 (3) в вакууме водоструйного насоса. Продукт сушат на фильтре продуванием воздуха с помощью водоструйного насоса в течение 1 ч, затем переносят в круглодонную колбу и сушат в течение 30 мин при остаточном давлении 2-4 мм рт. ст. Содержание темозоломида в полученных образцах анализируют методом ВЭЖХ относительно стандартного образца от компаниис заявленным содержанием темозоломида не менее 98 . Массы образцов очищенного темозоломида и содержание в них темозоломида приведены в табл. 2. Из полученных данных видно, что методика характеризуется хорошей воспроизводимостью. Таблица 2 Условия очистки темозоломида кипячением в сухом ацетоне Масса введенного Масса Среднее Содержание в очистку образца, полученного содержание примера темозоломида,г образца, г темозоломида,12 102,00 0,50 0,35 101,51,6 13 100,80 14 101,68 15 101,90 0,50 0,34 101,50,8 16 101,39 17 101,39 Образцы темозоломида, полученные в соответствии с примерами 1-17, охарактеризованы методами ЯМР и ИК-спектроскопии, проведен сравнительный анализ с помощью ВЭЖХ, определены температуры плавления, получены микрофотографии образцов кристаллов. Спектры ЯМР 1 полученных образцов были записаны дейтерированной воде или ДМСО-6 на приборе 400 с рабочей частотой 400 МГц. Химические сдвиги измерялись по шкалеотносительно сигнала ацетона (2,22 м.д.) и метанола (3,34 м.д.) в дейтерированной воде. ИК-спектры веществ снимались на приборе 70 в таблетках из бромида калия. Хроматографическое исследование проводилось с использованием жидкостного хроматографа 1200, укомплектованного детектором на основе диодной матрицы, термостатом колонок, колонкой для хроматографии-18 (154,6 мм,размер зерна 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовался раствор, содержащий 0,5 уксусной кислоты/ацетонитрил/триэтиламин в соотношении (об. ) 96,9/3/0,1 соответственно. Скорость подвижной фазы - 1 мл/мин. Температура хроматографической колонки - 25 С. Детектирование осуществлялось при 254 нм. В качестве стандарта использовался образец темозоломида производства компании . Морфологию структурных элементов изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа 1420. Температуру плавления определяли на приборе(. 9612) в стеклянных капиллярах с внутренним диаметром 1 мм, запаянных с одного конца. Взвешивание веществ и образцов проводили на весах ВЛР-1, заводской 86. Спектроскопия ЯМР. В спектре ЯМР 1 (2) полученных образцов очищенного темозоломида наблюдаются характерный синглет от протонов метальной группы при 4,01 (3) и синглет от протона имидазольного кольца при 8,65 (1), что согласует 4 15961 1 2012.06.30 ся с данными литературы. В качестве внутренних стандартов для определения химического сдвига использовались метанол (синглет при 3,34 м.д.) и ацетон (синглет при 2,22 м.д.). Полученный спектр ЯМР 1 Н соответствовал снятому в тех же условиях спектру стандартного образца темозоломида, приобретенного у компании(фиг. 1). Спектр ЯМР 1 (2) исходного сольвата темозоломида с ДМСО дополнительно содержит характерный синглет от протонов ДМСО при 2,72 м.д. После его кипячения с сухим или водным ацетоном интенсивность сигнала от протонов ДМСО в спектре значительно уменьшается. Так, на фиг. 2 приведены спектры ЯМР 1 неочищенного сольвата темозоломида с ДМСО (внизу) и темозоломида, очищенного кипячением в сухом ацетоне, как описано в примере 1 (вверху). Соотношение интегральных интенсивностей сигналов метильной группы темозоломида (4,01 м.д.) к сигналу метильных групп ДМСО(2,72 м.д.) в спектре неочищенного сольвата составляет около 12, что соответствует мольному соотношению темозоломид ДМСО 11. После очистки кипячением в ацетоне соотношение интегральных интенсивностей составляет около 1901, что соответствует мольному соотношению темозоломид ДМСО 3801 и массовому соотношению 9451(около 0,11 остаточного ДМСО). ИК-спектроскопия. В ИК-спектрах полученных образцов очищенного темозоломида наблюдались характерные полосы поглощения карбонильных групп при 1679, 1733 и 1759 см-1 и полосы поглощенияамидной группы при 3114, 3388 и 3422 см-1. ИКспектр синтезированного образца темозоломида соответствовал ИК-спектру стандартного образца темозоломида, приобретенного у компании(фиг. 3), в том числе в области отпечатков пальцев. Кроме того, полученный ИК-спектр соответствовал приведенному в литературе 6. Температура плавления. Для оценки индивидуальности и чистоты полученных образцов очищенного темозоломида проводили сравнение их температур плавления с литературными данными и с температурой плавления стандартного образца, приобретенного у компании , в одинаковых условиях. В патенте 8 и статье 9 имеется указание, что темозоломид плавится при температуре 210 С и темнеет при температуре от 160 до 210 С. Нами было обнаружено, что изменение цвета образца сильно зависит от скорости нагревания. Так, при быстром нагревании до 185 С (20 С в минуту) синтезированного и очищенного образца темозоломида при достижении температуры 165-170 С он начинает приобретать желтовато-розовый цвет и при дальнейшем нагреве до 185 С окраска углубляется. При последующем медленном нагревании (1 С в минуту) образец становился темно-коричневым и затем почти черным при достижении температуры 193-196 С. Признаков плавления образца при этом замечено не было. Если же постоянно проводить быстрый нагрев образца (20 С в минуту) до температуры 230 С, то его почернение происходит при температуре 205-212 С без признаков плавления. Аналогичные свойства проявлял стандартный образец от компании . Определение температуры плавления или разложения темозоломида не может служить строгим критерием оценки его чистоты,так как зависит от скорости нагрева образца. Заявляемый способ обеспечивает упрощение методики выделения темозоломида из его сольвата за счет уменьшения количества стадий и времени их проведения в 3-4 раза в сравнении с прототипом. Данный способ позволяет получать темозоломид в виде кристаллического порошка. Источники информации 1., ,/ ... .-,., 2003.- 164 . 5 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8