Способ выделения и очистки апротинина

14/47, 14/81, 61 38/57 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Открытое акционерное обществоБелмедпрепараты(72) Авторы Дидоренко Антонина Ивановна Ермоленко Михаил Никифорович Петров Петр Тимофеевич Ревко Лилия Петровна Свиридов Олег Васильевич Старовойтова Тамара Евгеньевна Стельмах Александр Ильич Царенков Валерий Минович(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(57) 1. Способ выделения и очистки апротинина, включающий гомогенизацию животного сырья, экстракцию, ионообменную хроматографию и гель-хроматографию, отличающийся тем, что перед ионообменной хроматографией супернатант, содержащий экстрагированный апротинин, нагревают до температуры 60-80 , выпавший осадок отделяют, а элюат,полученный в результате ионообменной хроматографии, перед гель-хроматографией предварительно концентрируют. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве животного сырья используют легкие крупного рогатого скота. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве животного сырья используют поджелудочную железу крупного рогатого скота. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюат концентрируют с помощью ультрафильтрации. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюат концентрируют с помощью ионообменной хроматографии.(56) Балабушевич Н.Г. Исследование методов выделения и разработка технологии получения поливалентного ингибитора протеиназ медицинского назначения из полупродуктов производства инсулина Дис.канд. - М., 1990. - С. 4-15.2088241 1, 1997.314523, 1971.299054, 1971.2890986, 1959.1492114, 1970.1070870, 1967.611595, 1978. 5157 1 Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к выделению и очистке биологически активных веществ, которые используются в качестве действующего вещества при производстве лекарств. Апротинин - основной ингибитор протеаз (трипсина,плазмина, тканевого и плазменного калликреина) широко используется в медицине при нарушении гемостаза в послеоперационном и послетравматическом периоде, до и после родов, при других нарушениях, требующих ингибирования протеолитических ферментов,например при острых и хронических панкреатитах. Апротинин является действующим веществом лекарств, выпускаемых различными фирмами (Трасилол - Байер, Германия,Тордокс - Венгрия). Известно несколько способов выделения апротинина из различных органов животных(слюнные железы, поджелудочная железа, легкие крупного рогатого скота). Один из них заключается в измельчении легких крупного рогатого скота, экстракции, адсорбции балластных белков на окиси магния, охлаждении супернатанта, высаждении апротинина ацетоном или спиртом и растворении его в дистиллированной воде или физиологическом растворе 1. Активность апротинина в растворе составляет 2500 и.е./мл раствора и повышается с 124,2 и.е./мл в исходном гомогенате до 695 и.е./мл после окончательной очистки. Таким образом, способ позволяет очистить апротинин только в 5,6 раза, а повышение антипротеазной активности до 2500 и.е./мл достигают концентрированием препарата. При этом сопутствующие белки также концентрируются и в результате удельная активность препарата не превышает 695 и.е./мг белка. Однако подобная процедура увеличения активности препарата делает его непригодным для изготовления лекарств. Препараты апротинина,предназначенные для внутривенного введения, должны быть максимально очищенными от посторонних белков, поскольку эти белки обладают антигенными свойствами и могут вызывать сильные иммунные реакции. Другой способ выделения апротинина заключается в измельчении легких крупного рогатого скота, экстракции соляной кислотой, центрифугировании экстракта, сульфатаммонийном фракционировании супернатанта, растворении осадка и повторном фракционировании сульфатом аммония, растворении полученного после повторного осаждения белков сульфатом аммония осадка и его лиофилизации. Активность полученного ингибитора протеаз составляет 650-700 и.е./мг белка 2. Полученный по данному методу препарат апротинина имеет низкую активность и содержит не более 10 целевого продукта. Такая степень очистки не позволяет использовать полученный данным методом апротинин в качестве субстанции при изготовлении лекарств. В качестве способа-прототипа выбран способ выделения и очистки апротинина из поджелудочной железы крупного рогатого скота 3. Способ заключается в гомогенизации поджелудочной железы, экстракции гомогената, вакуумной дистилляции, отделении балластных веществ, ионообменной хроматографии, подкислении элюата, содержащего продукт, соляной кислотой, центрифугировании образовавшегося осадка, внесении в супернатант трихлоруксусной кислоты, удалении образовавшегося осадка центрифугированием, осаждении апротинина из супернатанта насыщением его хлористым натрием и центрифугировании. Полученный таким образом сырец апротинина обрабатывали активированным углем для удаления низкомолекулярных окрашенных соединений и окончательно очищали гель-хроматографией. После гель-хроматографии апротинин осаждали и сушили ацетоном. Полученный данным способом апротинин был не менее 92 чистоты и имел удельную активность до 5600 и.е./мг белка. Приведенный выше способ-прототип хотя и позволяет получать высокоактивный препарат, пригодный для производства фармацевтических препаратов, однако в технологическом отношении является многостадийным, сложным и длительным по времени. Многократные центрифугирования больших объемов жидкости, большой расход материалов (соляная кислота, трихлоруксусная кислота, хлористый натрий, ацетон) делают себестоимость апротинина, полученного данным способом, очень высокой. Кроме того,2 5157 1 длительная процедура выделения и очистки, по-видимому, приводит к потере активности апротинина. Так, апротинин 90 -ной чистоты должен иметь удельную активность не менее 6500 и.е./мг белка, в то время как активность полученного по способу-прототипу апротинина не превышала 5600 и.е./мг при 92-ной электрофоретической чистоте. Таким образом, известные способы выделения апротинина не позволяют получить препарат, который может быть действующим веществом для приготовления лекарственных препаратов, либо являются слишком сложными и длительными, что может приводить к потере активности как общего количества апротинина, так и активности высокоочищенного препарата в ходе выделения и очистки. Задачей данного изобретения является упрощение способа выделения и очистки апротинина из животного сырья и повышение удельной активности целевого продукта. В соответствии с поставленной задачей разработан способ выделения и очистки апротинина, который заключается в следующем. Животное сырье гомогенизируют, гомогенат экстрагируют. Супернатант, содержащий целевой продукт, нагревают до температуры 6080 , образовавшийся осадок отделяют. Далее проводят ионообменную хроматографию супернатанта с последующим концентрированием элюата и гель-хроматографию. В качестве исходного сырья используют легкие или поджелудочную железу крупного рогатого скота. Концентрирование элюата осуществляют с помощью ультрафильтрации или ионообменной хроматографии. Способ отличается от прототипа термической обработкой супернатанта, содержащего целевой продукт и концентрированием элюата после ионообменной хроматографии. Полученный после гель-хроматографии препарат апротинина содержит более 95 целевого продукта и имеет активность, равную или превышающую 6500 и.е./мг. Таким образом, предложенный способ позволяет получать высокоочищенный (95 ) и высокоактивный (6500 и.е./мг белка) препарат апротинина из животного сырья. Уже после ионообменной хроматографии препарат апротинина имеет удельную активность до 2500 и.е./мг. Концентрирование элюата после этой стадии также может приводить к дополнительной очистке апротинина независимо от процедуры концентрирования. Так, при концентрировании с помощью ультрафильтрации можно использовать предварительное удаление высокомолекулярных компонентов из смеси при пропускании смеси через мембрану, задерживающую высокомолекулярные примеси, в то время как низкомолекулярный апротинин (молекулярная масса 6500 дальтон) свободно проходит через поры мембраны и концентрируется на другой мембране, задерживающей белки с молекулярной массой более 5000 дальтон. При концентрировании с помощью хроматографии дополнительная очистка целевого продукта достигается за счет повышения белковой нагрузки на катионообменник и вытеснению с него компонентов смеси, обладающих меньшим зарядом. Эффективным приемом очистки оказалось нагревание супернатанта до 60-80 С. При этом часть белков выпадала в осадок и удалялась центрифугированием. В результате удалось удалить большое количество окрашенный белков и увеличить удельную активность апротинина с 10-15 и.е./мг до 15-25 и.е./мг. В результате получен препарат апротинина, который имеет одну полосу при -электрофорезе, выходит одним пиком при гель-хроматографии на сефадексе -50 и удельной активностью до 7000 и.е./мг. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного исполнения. Пример 1. Измельченные на мясорубке легкие крупного рогатого скота (1,0 кг) смешивали с 5 л дистиллированной воды, содержащей 50 мл ортофосфорной кислоты и 40 мл 20 раствора аОН, рН 4,0. Смесь гомогенизировали в течение 1 минуты на гомогенизаторе тип-302 при 5000 об/мин. Экстракцию апротинина проводили при перемешивании в течение 2-х часов при температуре 20 С. Центрифугировали смесь при 300010 мин. Устанавливали в супернатанте рН 8,0, добавлением раствора , нагревали до 70 С и выдерживали при этой температуре 10 мин. После этого выпавший осадок отделяли 3 5157 1 центрифугированием супернатант наносили на колонку с катионообменником КУ-23 со скоростью 1 колоночный объем в час. После окончания нанесения колонку последовательно промывали дистиллированной водой до исчезновения в промывных водах оптической плотности при 280 нм. Для элюции адсорбированного апротинина с катионообменника КУ-23 использовали раствор 1,2 Мс рН 11,0. После элюции получали препарат апротинина с максимальной удельной активностью 2500 и.е./мг. Выход апротинина составил 80 . Элюат концентрировали на установке для концентрирования белков с мембраной 5 000 дальтон. Концентрат наносили на колонку с сефадексом -50 , уравновешенную 0,01 М НС 1. Собирали белковый пик, обладающий антипротеазной активностью. Получили 250 мг белка с удельной активностью 7000 и.е./мг и с электрофоретической чистотой более 98 . Выход апротинина составил 70 . Полученный препарат лиофилизовали и хранили в герметичной закрытой посуде при 4 С. Пример 2. Измельченную на мясорубке поджелудочную железу крупного рогатого скота (1,0 кг) смешивали с 5 л 70 -ного этилового спирта, содержащего 50 мл ортофосфорной кислоты. Экстракцию апротинина проводили при перемешивании в течение 2-х часов при температуре 20 С, после чего удаляли спирт в вакуумно-выпарной установке до 10 -ной концентрации, центрифугировали смесь при 300010 мин. Устанавливали в супернатанте рН 8,0 добавлением раствора аОН, нагревали до 80 С и выдерживали при этой температуре 10 мин. После этого выпавший осадок отделяли центрифугированием, супернатант наносили на колонку с КУ-23 со скоростью 1 колоночный объем в час. После окончания нанесения колонку промывали последовательно дистиллированной водой и щелочью с рН 9,9 (для удаления инсулина) до исчезновения в промывных водах оптической плотности при 280 нм. Для элюции адсорбированного апротинина с КУ-23 использовали раствор 1,5 Мс рН 12,0. После элюции получали препарат апротинина с максимальной удельной активностью 1800 и.е./мг. Выход апротинина составил 76 . Концентрирование препарата апротинина проводили при повторном нанесении препарата на КУ-23 при рН 4,0 со скоростью 1 колоночный объем в час. Соотношение объема сорбента к количеству наносимого белка составляет 1200 л/кг. Элюцию апротинина проводили раствором аОН с р 12,5. Элюат после концентрирования наносили на колонку с сефадексом -50 ,уравновешенную 0,01 М НС 1. Собирали белковый пик, обладающий антипротеазной активностью. Получили 230 мг белка с удельной активностью 6700 и.е./мг и электрофоретической чистотой более 96 . Выход апротинина составил 62 . Полученный препарат концентрировали, стерилизовали и хранили в герметично закрытой посуде при 4 С. Источники информации 1. А.с. СССР 1119174/31-16, МПК А 61 К 19/2, 197. 2. А.с. СССР 1612362/31-16, Кл, А 61 к 19/00, 1973. 3. Балабушевич Н.Г. Исследование методов выделения и разработка технологии получения поливалентного ингибитора протеиназ медицинского назначения из полупродуктов производства инсулина Дис.канд. - М., 1990. - С. 4-15 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.