Способ получения каротиноидсодержащей биомассы, обладающей иммуностимулирующим и антиоксидантным действием

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРОТИНОИДСОДЕРЖАЩЕЙ БИОМАССЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ И АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Щерба Виктор Васильевич Бабицкая Валентина Григорьевна Бирман Борис Яковлевич Гвоздкова Татьяна Семеновна Буйко Наталья Вячеславовна Черноок Татьяна Владимировна Юдасин Аркадий Моисеевич Зинина Наталья Владимировна Иконникова Наталья Валерьевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)4914 С 1, 2003.5021 С 1, 2003.2257222 С 1, 2005. ГВОЗДКОВА Т.С. и др. Успехи медицинской микологии. Материалы третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Т - М., 2005. С. 257-259. КАПИЧ А.Н. и др. Проблемы микологии и биотехнологии. Материалы международной конференции. - Минск,1998. - С. 52-53.(57) 1. Способ получения каротиноидсодержащей биомассы, обладающей иммуностимулирующим и антиоксидантным действием, из гриба-продуцента,включающий глубинное культивирование гриба на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим получением биомассы путем ее отделения от культурального фильтрата, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм грибаБИМ -361 Д, а глубинное культивирование ведут присреды 3,0-3,5. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каротиноидсодержащую биомассу дополнительно обрабатывают 15 -ной аскорбиновой кислотой и сушат при температуре не выше 60 С. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения биомассы микроорганизмов, содержащей комплекс биологически активных веществ, в том числе каротиноиды, которая может быть использована в качестве лечебнопрофилактического средства в животноводстве, птицеводстве, в пищевой промышленности, медицине. Каротиноиды (кетокаротиноиды, содержащие одну или несколько кетогрупп в молекуле) являются природными соединениями, биосинтез которых осуществляется лишь растениями и микроорганизмами. Человек и животные не способны синтезировать их и 13131 1 2010.04.30 должны регулярно получать с пищей в виду того, что они выполняют в организме целый ряд жизненноважных функций. Разнообразие функциональных свойств каротиноидных пигментов обусловливает и их биологическую ценность, связанную с антиканцерогенным,гиполипидемическим, радиозащитным и др. действиями. Принимая во внимание способность каротиноидов связывать активный кислород и защищать клеточные структуры от разрушения свободными радикалами, образующимися под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды, применение каротиноидсодержащих препаратов, в т.ч. биомасс, в перечисленных областях весьма перспективно 1-3. Известны многочисленные примеры использования -каротина, других каротиноидов (зеаксантин, астаксантин и др.), а также различных их композиций и других пигментов желтой или оранжевой окраски (например, хинонов, убихинона 10), полученных на основе микробного синтеза, в качестве пищевых и кормовых добавок, лечебно-профилактических и косметических средств, красителей и др. 4, 5. Недостатком данных способов является использование для получения пигментсодержащей биомассы низшего грибаВКПМ 867 в смеси с пробиотиком Авилак-1 К. Гриб синтезирует не каротиноидный пигмент, обладающий широким спектром действия, а незначительные количества пигмента убихинона 10. Использование для получения кормовой добавки комплекса соединений гриба и пробиотиков удорожает стоимость препарата. Известен способ получения и использования кетокаротиноидов, в частности астаксантина и астаксантинсодержащей биомассы на основе мутантных штаммов дрожжей, в качестве добавки в различные пищевые продукты, в корм домашней птице и в аквакультуру как фармацевтическое средство, в косметической промышленности и др. Недостатком данного способа является низкая продуктивность штамма дрожжей выход биомассы - 8-10 г/л и каротиноидов 3000-8000 мкг/г сухой биомассы, высокое содержание в биомассе вредных для организма нуклеиновых кислот (свыше 8 ), а также то, что с целью получения биомассы культивирование дрожжей проводят на сложных дорогостоящих питательных средах, в состав которых входят дрожжевой экстракт, витамины, ростактивирующие вещества. Культивирование дрожжей ведется в строго стерильных условиях 6. Известен способ получения средства, обладающего радиозащитным действием путем культивирования мицелия гриба на питательной среде, экстракции его этиловым спиртом,при этом в качестве продуцирующего кетокаротиноиды (каротиноиды) гриба используют(. .) , экстракцию проводят при соотношении мицелия и этилового спирта 120, а разведение экстракта осуществляют до содержания каротиноидов 2,0-2,5 мкг/мл 7. Недостатками указанного способа являются длительный (до 46 сут.) процесс получения каротиноидсодержащего мицелия 10-14 сут. - выделение мицелиальной культуры из плодового тела гриба на твердой питательной среде 14 сут. - выращивание мицелиальной культуры в пробирках на скошенном суслоагаре 12-14 сут. - выращивание гриба в жидкой питательной среде с целью получения инокулюма 6 сут. - получение мицелия. использование для глубинного культивирования гриба дорогостоящей питательной среды (глюкоза - 20 г/л, пептон - 5 г/л, кукурузный экстракт - 3 г/л). Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату является Способ получения кетокаротиноидов 8. Каротиноиды (кетокаротиноиды) получают путем глубинного культивирования штамма 131 в колбах на качалке на глюкозо-пептонной среде следующего состава, г/л глюкоза - 15,0 пептон - 3,0 КН 2 РО 4 0,6 К 2 НРО 42 Н 2 О - 0,4 47 Н 2 О - 0,5 кукурузный экстракт - 3,0 мл/л. Культивирование гриба осуществляют при рН среды 2,0-3,0, температуре 26-28 в течение 7 сут. 2 13131 1 2010.04.30 Содержание кетокаротиноидов (каротиноидов) в биомассе составляет 5950 мкг/г при извлечении этиловым спиртом и 11640 мкг/ г - при извлечении ацетоном. Однако штамм и получаемый на его основе мицелий характеризуются недостаточно высоким содержанием основного вещества - кетокаротиноидов. Недостатками данного способа получения кетокаротиноидов являются низкий выход биомассы (8-10 г/л) при глубинном культивировании гриба сравнительно низкое содержание в биомассе кетокаротиноидов (5950 мкг/г, особенно при использовании нетоксичного экстрагента этилового спирта, поскольку использование ацетоновых экстрактов недопустимо в кормовой, пищевой и фармацевтической промышленностях) отсутствие в экстракте полноценного комплекса физиологически активных соединений (ФАС), присущих мицелию гриба (липидов, белков, углеводов, минеральных элементов фенольных соединений) использование для культивирования гриба при получении кетокаротиноидов дорогого сырья глюкоза, пептон, кукурузный экстракт длительность культивирования используемого штамма-продуцента - 7 сут. Задачей данного изобретения является разработка более экономичного способа получения каротиноидсодержащей биомассы гриба путем использования нового штамма, более технологичного и продуктивного, способного расти на дешевых субстратах и образовывать каротиноидсодержащую биомассу в более короткие сроки, а также стабилизация каротиноидсодержащей биомассы. Поставленная задача достигается путем использования для получения каротиноидсодержащей биомассы иммуностимулирующего и антиоксидантного действия более эффективного нового штамма - .БИМ- 361 Д, синтезирующего более чем в 1,7 раза большее количество биомассы (14-16 г/л против 8-10 г/л) повышенное содержание в биомассе каротиноидов (до 13000-15000 мкг/г при экстрагировании этиловым спиртом и 16000-18000 мкг/г при экстрагировании ацетоном против 5950 мкг/г и 11640 мкг/г соответственно у прототипа) естественный для человека и животных комплекс ФАС каротиноиды, липиды, полиеновые жирные кислоты, фосфолипиды, эргостерин, белок, углеводы, фенольные соединения использующего для роста и продукции каротиноидов дешевое сырье (ржаную или пшеничную, или ячменную муку и картофельный крахмал без добавления солей и факторов роста отличающегося более высокой скоростью роста (4-5 сут против 7 сут) в предлагаемом способе с целью повышения стабильности и сохранности липокаротиноидного комплекса биомассу перед сушкой предлагается обрабатывать 15 -м раствором аскорбиновой кислоты в соотношении 110. Предлагаемый штамм .БИМ - 361 Д выделен из плодовых тел гриба трутовика серно-желтого, росшего на пне дуба, Беларусь, Минский район, дер. Глебковичи. Штамм депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории экспериментальной микологии ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4-6 С на сусло-агаре. Культурально-морфологическая характеристика. На сусло-агаре колонии мучнистые,хлопьевидно-опушенные, оранжево-красноватые или розоватые, медленно растущие, реверзум не изменяет окраски. Генеративные гифы септированные, широкие с окрашенными включениями оранжево-красного цвета, без пряжек, нормально ветвящиеся, имеют терминальные и интеркалярные хламидоспоры. Глубинный мицелий в виде пеллет от ярко 3 13131 1 2010.04.30 оранжевого до красного цвета, достигающих в диаметре 0,2-0,5 мм и более, в зависимости от условий культивирования. Запах глубинного мицелия медовый. Физиолого-биохимическая характеристика. Оптимальные значения рН среды -3,0-3,5(т.е. его можно отнести к ацидофильным), температурный оптимум - 26-28 С, видимый свет стимулирует образование кетокаротиноидов. Культура утилизирует в качестве единственного источника углерода моно-, ди- и полисахариды, сахароспирты. Лучшими источниками углерода, как для роста, так и для синтеза каротиноидов являются глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и крахмал. Из минеральных источников азотного питания для гриба наиболее доступными являются аммонийные формы азота, а из органических - пептон, дрожжевой автолизат, кукурузный или дрожжевой экстракты. Штамм не является зоо- и фитопатогенным. Токсикологические исследования проводились на лабораторных животных крысы, беспородные белые мыши, морские свинки,кролики, цыплята-бройлеры. Установлено, что сам штамм, экстракты и каротиноидсодержащая биомасса не обладают кумулятивными свойствами, раздражающим и общерезорбтивным действием, на основании чего сделан вывод об их безвредности. Сведения, подтверждающие получение каротиноидсодержащей биомассы и возможность осуществления предлагаемого изобретения Пример 1. Культуру гриба .БИМ- 361 Д выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре при 25-27 С в течение 8-10 сут. Посевной материал выращивают на пивном неохмеленном сусле (7-8 Б), которое разливают по 200 мл в конические колбы объемом 0,5 л или по 400 мл в колбы объемом 1,0 л, или по 750 мл в колбы объемом 2,0 л и засевают смывом - 1-3 косяка на колбу. Инокулюм выращивают на круговой качалке (160-180 об/мин) при 25-27 С и используют для засева ферментера объемом 30 л с 25 л питательной среды следующего состава ржаная мука - 30,0 г/л, картофельный крахмал -10,0 г/л. Количество посевного материала 10 . Условия культивирования интенсивность аэрации - 0,5-1,0 л/л среды/мин. скорость перемешивания - 50 об/мин рН среды - 3,0-3,5 температура- 25-27 С длительность культивирования - 96-120 ч. Полученный мицелий отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, отжимают, обрабатывают 15 -й аскорбиновой кислотой при соотношении 110 с целью стабилизации липокаротиноидного комплекса и сушат при температуре не выше 60 С. Без обработки количество каротиноидов в биомассе составляет 10000-13000 мкг/г, с обработкой - 13000-15000 и 16000-18000 мкг/г при экстрагировании этанолом и ацетоном. Дальнейшее увеличение концентрации аскорбиновой кислоты незначительно (на 0,5-1,0 ) повышает стабильность и содержание каротиноидов, однако это экономически не выгодно. Экономически не выгодно и увеличение соотношения свыше 110 (аскорбиновая кислота биомасса). Сушка при более низких температурах удлиняет процесс получения каротиноидсодержащей биомассы, при более высоких - приводит к окислению липокаротиноидного комплекса. Биомасса гриба имеет следующий состав выход биомассы 14,0 г/л каротиноиды 14000 мкг/г (экстракция этанолом) 18000 мкг/г (экстракция ацетоном) липиды 24,0 линолевая кислота 70,0(от суммы жирных кислот) 4 13131 1 2010.04.30 фосфолипиды 1,5 эргостерин 1,6 белки 22,0 углеводы 46,0 нуклеиновые кислоты 2,0 минеральные вещества 3,5 фенольные соединения 2000 мг . Пример 2. Выращивание гриба осуществляют аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется пшеничная мука в количестве 30,0 г/л и картофельный крахмал - 10,0 г/л. Биомасса гриба имеет следующий состав выход биомассы 16,0 г/л каротиноиды 15000 мкг/г (экстракция этанолом) 16000 мкг/г (экстракция ацетоном) липиды 26,0 линолевая кислота 75,0(от суммы жирных кислот) фосфолипиды 1,7 эргостерин 1,5 белки 24,0 углеводы 45,0 нуклеиновые кислоты 1,5 минеральные вещества 3,0 фенольные соединения 2500 мг . Пример 3. Выращивание гриба осуществляют аналогично изложенному в примерах 1, 2. В качестве питательной среды используется пшеничная мука в количестве 15,0 г/л, ячменная мука 15,0 г/л и картофельный крахмал - 10,0 г/л. Биомасса гриба имеет следующий состав выход биомассы 15,0 г/л каротиноиды 13000 мкг/г (экстракция этанолом) 17000 мкг/г (экстракция ацетоном) липиды 28,0 линолевая кислота 65,0(от суммы жирных кислот) фосфолипиды 1,5 эргостерин 1,2 белки 22,0 углеводы 43,0 нуклеиновые кислоты 1,5 минеральные вещества 3,5 фенольные соединения 2100 мг . Антиоксидантная активность спиртовых экстрактов биомассы гриба, обусловленная повышенным уровнем полиеновых липидных компонентов - каротиноидов, фосфолипидов, линолевой кислоты, а также фенольных соединений составляет 80-90 по отношению к ионолу. Полученная предлагаемым способом грибная биомасса обладает приятным вкусом и грибным ароматом, содержит естественные для животных и человека белки (22-24,0 ),все незаменимые аминокислоты, в т. ч. лизин - 5,8-6,5 , цистинметионин - 4,1-5,0 ,лейцин - 5,3-6,0 , фенилаланин - 5,2-6,0 и др., значительный набор макро- и микроэлементов (мг/100 г) К (366-410),(370-390), Са (670-690),(27-40),(1-3), фенольные соединения (2000-2500 мг ). 5 13131 1 2010.04.30 Таким образом, использование предлагаемого способа получения каротиноидсодержащей биомассы иммуностимулирующего и антиоксидантного действия путем глубинного культивирования нового штамма гриба .БИМ- 361 Д на дешевых средах позволяет повысить выход биомассы, содержание в ней каротиноидов, полноценных ФАС, использовать дешевое сырье без добавления солей и факторов роста и сократить сроки культивирования. Таблица 1 Сравнительная характеристика предлагаемого способа получения каротиноидсодержащей биомассы и прототипа Предлагаемый способ получения Прототип Патент РБ 4914 Биомасса - 14-16 г/л Биомасса - 8-10 г/л Каротиноиды - 13000-15000 мкг/ при Каротиноиды - 5950 мкг/г при экстрагировании экстрагировании этиловым спиртом этиловым спиртом(экстракция ацетоном) ФАС каротиноиды, липиды, белки,ФАС нет углеводы, фенольные соединения Сырье ржаная, пшеничная, ячменная мука, Сырье глюкозо-пептонная среда - глюкоза,картофельный крахмал, без добавления пептон, кукурузный экстракт, минеральные солей соли Время культивирования - 4-5 сут Время культивирования - 7 сут Существенно и то, что у штамма .БИМ- 361 Д обнаружены новые неизвестные ранее для грибов .свойства способность синтезировать значительное количество фенольных соединений (до 2500 мг ) - натуральных антиоксидантов, образовывать большое количество (до 28 ) липидов, а у каротиноидсодержащей биомассы высокий иммуностимулирующий эффект, высокая антиоксидантная активность. Иммуностимулирующее действие каротиноидсодержащей биомассы изучали, используя фагоцитарный тест, основанный на определении поглотительной способности нейтрофилов крови человека по отношению к микробной тест-культуре () после их совместной инкубации. В опытахустановлено, что каротиноидсодержащая биомасса, полученная путем глубинного культивирования .БИМ 361 Д, оказывает стимулирующий эффект на фагоцитарную активность нейтрофилов в концентрации 100-150 мкг/мл. Исследовано иммуностимулирующее действие каротиноидсодержащей биомассы и в опытах. В эксперименте были использованы беспородные мыши, получавшие ежедневно в течение 10 сут.биомассу из расчета 50,0 мг/кг. Индукция иммунного ответа производилась суспензией эритроцитов барана (0,1 мл суспензии в концентрации 1108 клеток/мл на мышь) по стандартной схеме иммунизации. Мицелий при введениине оказывал влияния на массу тела, уровень лейкоцитов, лейкоцитарную формулу,фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и состояние системы комплимента. Иммунотропный эффект грибной биомассы направлен в основном на усиление клеточного иммунного ответа, что проявляется достоверным увеличением индекса ГЗТ(реакция гиперчувствительности замедленного типа), селезеночного индекса. Прослеживалась тенденция к увеличению гемагглютининов класса М и . Подтверждением иммуностимулирующего действия каротиноидсодержащей биомассы является изучение влияния ее на напряженность поствакцинального иммунитета цыплят (табл. 2). 6 13131 1 2010.04.30 Таблица 2 Влияние каротиноидсодержащей биомассы на напряженность поствакцинального иммунитета цыплят Титр поствакциналь к контролю ных антител к БН,2 1 -я опытная 0,72 5,431,1 114,5 2-я опытная 1,43 6,851,3 144,5 3-я опытная 2,15 6,790,35 143,2 Контрольная 4,740,71 100 На цыплятах-бройлерах установлено антиоксидантное, ростстимулирующее и адаптогенное действие каротиноидсодержащей биомассы. Прирост цыплят составил 12-40 Таблица 3 Динамика прироста массы тела цыплят-бройлеров Масса цыплят Среднесуточный На 15-й день На 30-й день привес, г В начале опыта опыта опыта Опытная 1 277,716 666,947,7 711,5752,73 433,87 Опытная 2 268,211,43 51931,1 703,439,2 435,2 Контрольная 2589,6 56024,1 651,6739,1 393,67 Гематологические и биохимические показатели крови цыплят-бройлеров подопытных групп находились в пределах физиологической нормы. Но отмечена общая тенденция увеличения количества эритроцитов, гемоглобина, липидов и белка. У цыплят опытной группы активность фермента аланинаминотрансферазы (АлАТО) была на уровне цыплят контрольной группы, что является косвенным показателем гепатопротекторного, антиоксидантного и адаптогенного действия каротиноидсодержащей биомассы гриба (табл. 4). Группа контроль 2 опыт 3 опыт 4 опыт Эритроциты, млн 2,850,19 2,970,34 3,340,3 3,640,48 Гемоглобин, г/л 875,85 91,53,84 113,253,33 98,255,72 Общие липиды, г/л 7,951,01 10,331,3 8,70,59 11,341,13 Холестерин, моль/л 5,290,18 5,370,16 6,040,36 6,030,45 АлАТ, мккат/л 0,100,01 0,110,01 0,0970,01 0,1130,003 АсАТ, мккат/л 0,7650,08 0,720,005 0,7190,02 0,710,004 Белок, г/л 36,83,07 41,41,33 38,20,49 41,40,40 Альбумин, г/л 14,150,99 16,471,15 16,061,03 15,280,24 У цыплят-бройлеров отмечено снижение продукта липопероксидации - малонового диальдегида (МДА), что подтверждает антиоксидантное действие каротиноидсодержащей биомассы (табл. 5). 7 Таким образом, предлагаемый способ получения каротиноидсодержащей биомассы иммуностимулирующего и антиоксидантного действия позволяет по сравнению с прототипом 1) получать на 50-60 большее количество биомассы 2) на 40-46 большее количество в биомассе каротиноидов 3) получать в каротиноидсодержащей биомассе уникальный комплекс ФАС 4) использовать дешевое растительное сырье без применения минеральных солей и ростстимулирующих веществ 5) использовать новый высокоэффективный штамм, скорость роста которого в 1,7 раза больше скорости прототипа 6) стабилизировать на 23-50 каротиноидсодержащую биомассу. Полученный эффект обусловлен использованием нового штамма гриба . е БИМ- 361 Д, применением для его выращивания дешевого и доступного сырья - ржаной,пшеничной, ячменной муки, полученных из фуражного зерна, и картофельного крахмала без применения минеральных солей, использованием для стабилизации каротиноидсодержащей биомассы 15 -ной аскорбиновой кислоты и преимуществами заявляемого способа. Источники информации 1. - //. - 1991. - . 63. -3. - . 147-156. 2.,.,..//. - 1997. - . 1336. - . 575-586. 3. Виленчик М.М. и др. Радиозащитное действие природных каротинсодержащих препаратов исследование каротина на белых крысах // Радиобиология. - 1998. - Т. 28. -4. С. 542-544. 4.Патент 2004112505, МПК 7 А 23 1/16. 5.Патент 2286066, МПК 7 А 23 1/16, А 23 1/165. 6.Патент 5356810, МПК 7 С 12 Р 23/00, С 12 1/16, 1992. 7. РБ Патент 5021, МПК 7 А 61 35/84, А 61 Р 43/00, 1998. 8. РБ Патент 4914, МПК 7 С 12 Р 23/00, С 12 Р 1/02, 1998 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8