Способ получения средства, обладающего радиозащитным действием

61 43/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявители Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Капич Александр Николаевич Гвоздкова Татьяна Семеновна Конопля Евгений Федорович Верещако Геннадий Григорьевич Рутковская Жанна Александровна(73) Патентообладатель Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения средства, обладающего радиозащитным действием, путем культивирования мицелия гриба на питательной среде, экстракции его этиловым спиртом и разведения полученного экстракта дисциллированной водой, отличающийся тем, что используют гриб(. .) ., экстракцию производят при соотношении мицелия и этилового спирта 120, а разведение экстракта осуществляют до содержания каротиноидов 2,0-2,5 мкг/мл.(56)1824195 1, 1993.2059425 1, 1996. Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения радиозащитных средств природного происхождения и может найти применение в медицине для защиты организма от облучения, а также в клинической и сельскохозяйственной практике на территориях с радиоактивным загрязнением. В связи с возрастающей опасностью радиоэкологических кризисов, например, таких как после аварии на Чернобыльской АЭС, а также в связи с увеличивающимся хроническим природно-техногенным облучением, отрицательно влияющим на организм человека и животных, в последнее время осуществляется поиск новых средств природного происхождения, обладающих радиозащитным действием. Причем актуальным является создание таких средств, которые обладали бы радиозащитным действием в широком диапазоне доз как на фоне летальных, так и на фоне сублетальных и малых доз облучения. Известные химические радиопротекторы обладают радиозащитным действием при летальных дозах облучения и являются, как правило, неэффективными при сублетальных и малых дозах облучения. Более того, существенным недостатком классических химически синтезируемых радиопротекторов является их побочное токсическое действие, что ограничивает их срок применения. Природные средства, обладающие радиозащитным действием при 5021 1 малых дозах облучения, как правило, оказываются неэффективными при сублетальных и летальных дозах облучения. Известен способ получения средства, обладающего радиозащитным действием, путем масляной экстракции гриба 1. Введение крысам полученного каротинсодержащего средства двукратно, а именно за 4 и 19 ч перед облучением, подкожно илиснижает их гибель от острого лучевого поражения. Предполагается, что радиопротекторные свойства этого препарата обусловлены способностью каротина перехватывать активные формы кислорода, т.е. его антиоксидантными свойствами. Гриб, относящийся к классу , не образует макроскопических плодовых тел, в связи с чем идентификация и выделение его в чистую культуру затруднены. Радиозащитный эффект средства, полученного из этого гриба, относительно невелик по сравнению с известными радиозащитными препаратами. Наиболее близок к изобретению способ получения средства, обладающего радиозащитным действием, включающий культивирование мицелия базидиального грибана питательной среде и экстракцию его этиловым спиртом 2. Однако данное средство эффективно только при облучении животных летальными дозами облучения (6.0 Гр) при высокой мощности дозы (0,055 Гр/с) и не оказывает положительного действия при малых дозах облучения. Способ включает сложную энергоемкую процедуру концентрирования экстракта в 100 раз под вакуумом при температуре не выше 3540 С. Кроме того, данный гриб образует относительно небольшого размера плодовые тела, что затрудняет получение его чистых культур. Задачей данного изобретения является расширение сырьевой базы и разработка простого способа получения средства, обладающего радиозащитным действием в широком диапазоне доз облучения как на фоне летальных, так и на фоне сублетальных и малых доз облучения. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения средства, обладающего радиозащитным действием, предусматривающим культивирование мицелия гриба на питательной среде, обработку его экстрагентом и получение конечного продукта, из грибов используют(. .) ., экстракцию проводят этиловым спиртом при соотношении мицелия экстрагент - 120, а конечный продукт готовят путем разведения экстракта дистилированной водой до содержания каротиноидов 2,0-2,5 мкг/мл. Данный гриб (. ) до сих пор в медицине не использовался. Нами установлено новое ранее не известное свойство разведенных спиртовых экстрактов мицелия ., заключающееся в том, что они обладают радиозащитным действием, причем это действие проявляется в широком диапазоне доз как на фоне летальных, так и на фоне сублетальных и малых доз облучения при концентрации каротиноидов в средстве 2,0-2,5 мкг/мл. Радиозащитное действие средства на основе спиртовых экстрактов мицелия гриба .сочетается с его высокой антиокислительной активностью. Поскольку в известных технических решениях признаков, совпадающих по свойствам с отличительными признаками предложенного технического решения не обнаружено,следовательно, последнее обладает существенными отличиями. В качестве сырья для получения средства, обладающего радиозащитным действием,используют мицелий гриба . . Гриб .является очень широко распространенным видом, известен на всех континентах, в разных климатических зонах. Растет на живой и отмершей древесине лиственных (чаще всего на дубе), реже на некоторых хвойных. Вызывает бурую сердцевинную гниль древесины. Плодовые тела водянистомясистые, в дальнейшем при высыхании твердеющие и ломкие 10-40 см в диаметре, 1-4 см в толщину. По форме полукруглые, веерообразные или языковидные. К субстрату прикрепляются боковой стороной, растут группами, часто образуют черепитчатые наслоения,располагающиеся на общем основании. 5021 1 Сверху плодовые тела гладкие, радиально-волнистые либо радиально-морщинистые,часто с лопастно-волнистым, слегка подогнутым краем, с возрастом желтовато-оранжевые или оранжево-розовые, с серно-желтым оттенком, с возрастом желтовато-оранжевые,бледно-желтые, выцветающие. Ткань мягкая, мясистая до сырообразной, желтоватобеловатая, с возрастом более жесткая. Снизу плодового тела располагается трубчатый гименофор. Трубочки желтоватые или серно-желтые, длиной 1-4 мм, с округлыми или угловатыми порами (диаметр 0,2-0,8 мм). Споровый порошок беловатый, с желтоватым оттенком. Базидоспоры 5-73,5-5 мкм, широкоэлипсоидальные или яйцевидные, гладкие,бесцветные или бледно-желтоватые. Мицелиальные культуры, получаемые из плодовых тел гриба, имеют следующие культурально-морфологические особенности на сусле-агаре колонии мучнистые, хлопьевидно-опушенные, оранжево-красноватые или розоватые, медленно растущие, реверзум не изменяет окраски. Реакция на лактазу, тирозиназу, пероксидазу и экстрацеллюлярные оксидазы - отрицательная. Генеративные гифы септированные, без пряжек. Образует хламидоспоры и конидии. Перечисленные признаки позволяют легко идентифицировать мицелиальные культуры при получении их из плодовых тел. Предложенный способ осуществляется следующим образом. Из плодовых тел гриба . , собранных в природе, выделяют мицелиальную культуру на твердой питательной среде. Далее мицелий гриба выращивают на жидкой питательной среде в глубинной культуре. Мицелий отделяют фильтрованием и экстрагируют этиловым спиртом при соотношении мицелийэкстрагент 120. В полученном экстракте определяют содержание каротиноидов и разводят его дистиллированной водой таким образом, чтобы содержание каротиноидов в конечном продукте составляло 2,0-2,5 мкг/мл. Пример. Выбирают крупные плодовые тела гриба .удаляют их с поверхности скальпелем растительные остатки. После механической очистки плодовые тела обтирают вначале сухой стерильной ватой, а затем ватой, смоченной в этиловом спирте. Разламывают плодовое тело и стерильным скальпелем переносят части ткани в чашки Петри на поверхность агаризованной питательной среды - сусло-агар. Чашки помещают в термостат при температуре 26-28 С. На 10-14-е сутки появившийся мицелий из зоны роста пересевают в следующую чашку с сусло-агаром для изучения культурально-морфологических свойств и уточнения видовой принадлежности гриба. Затем мицелиальую культуру пересевают в пробирку со скошенным сусло-агаром и выращивают в течение 14 суток. Культуру засевают смывом в жидкую питательную среду следующего состава, в г/л глюкоза - 20,пептон - 5, КН 2 РО 4 -1,5, 4720 - 0,7. Кукурузный экстракт - 3, начальный рН - 3,0. Глубинное культивирование проводят в колбах на качалке в течение 12-14 суток при температуре 26-28 С. Выросший мицелий измельчают путем встряхивания в колбе со стерильными бусами и используют для посева глюкозо-пептонной среды аналогичного состава. Посевной материал вносят в количестве 10 от объема питательной среды, а культивирование проводят в течение 6 суток при тех же условиях. Мицелий отделяют фильтрованием и экстрагируют этиловым спиртом. Сначала мицелий гомогенизируют в небольшом количестве спирта, а затем проводят трехкратную эктракцию этиловым спиртом, так чтобы общее соотношение мицелийэкстрагент составляло 120. Полученный экстракт фильтруют под вакуумом на стеклянном фильтре. Определяют содержание каротиноидов в экстракте спектрофотометрически при длине волны 450 нм с использованием при расчетах следующей формулы где- оптическая плотность разведенного экстракта Разв. - разведение экстракта 2500 - коэффициент удельного поглощения. После этого рассчитывают какое количество дистил 3 5021 1 лированной воды необходимо добавить к экстракту, чтобы содержание каротиноидов в конечном продукте составляло 2,0-2,5 мкг/мл. Полученное средство обладает радиозащитным действием в широком диапазоне доз облучения как на фоне летальных, так и на фоне сублетальных и малых доз облучения. В условиях летального гамма-облучения (12,0 Гр, мощность дозы 5,4 сГр./мин) крыссамцов стадного разведения в возрасте 6 месяцев получение средства животными в виде питья при свободном доступе в течение 1 суток до облучения обеспечивало их выживаемость на уровне 88,9 , при этом средняя продолжительность жизни на 30-е сутки после облучения составляла 29 суток, т.е. не меньше, чем в прототипе (28,8). Таким образом,получаемое по предлагаемому способу средство обладает высокоэффективным радиозащитным действием на фоне летальной дозы облучения (12,0 Гр) даже более высокой, чем в прототипе (6,0 Гр). Сублетальные и малые дозы облучения не вызывают быстрой гибели животных, однако под их воздействием происходят морфофункциональные изменения у животных, свидетельствующие о развитии патологических процессов. Особую роль при этом играют нарушения в системах антиоксидантной защиты организма. Однократное гамма-облучение в малой дозе (1,0 Гр, мощность дозы 5,4 сГр.мин) вызывает снижение антиоксидантной активности плазмы крови у животных (крысы-самцы стадного разведения в возрасте 2,5 месяцев) на 30-е сутки после облучения с 1,12 усл. ед. у интактных животных до 0,70 усл. ед. - у облученных. Введение полученного по предлагаемому способу средства животным в виде питья при свободном доступе в течение 1 суток до облучения нормализовало антиоксидантную активность плазмы крови (1,17 усл. ед.) у облученных в малых дозах животных. Аналогичный эффект оказывало получаемое по предлагаемому способу средство и на животных, облучаемых в сублетальных дозах. Однократное гамма-облучение в сублетальной дозе (4,0 Гр, мощность дозы 5,4 сГр/мин) вызывает снижение антиоксидантной активности плазмы крови у животных (крысы-самцы стадного разведения в возрасте 2 месяцев) на 120-е сутки после облучения с 1,19 усл. ед. у интактных животных до 0,84 усл. ед. у облученных. Введение средства животным в виде питья при свободном доступе в течение 1 суток до облучения не только нормализовывало, но даже супервосстанавливало антиоксидантную активность у облученных в сублетальных дозах животных (1,35 усл. ед.),т.е. при применении средства данный показатель становился выше, даже чем у интактных необлученных животных. Таким образом, получаемое по предлагаемому способу средство обладает радиозащитным и антиоксидантным действием в широком диапазоне доз. Источники информации 1. Виленчик М.М. и др. Радиозащитное действие природных каротинсодержащих препаратов исследование каротинила на белых крысах. Радиобиология. - 1988. - Т. 28. -4. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4