Способ получения L-тироксина

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявители Совместное Общество с ограниченной ответственностью БЕЛОРИС Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(72) Авторы Ермоленко Михаил Никифорович Мартинович Вера Павловна Петров Петр Тимофеевич Царенков Валерий Минович Свиридов Олег Васильевич Чащин Вадим Леонидович Стрельченок Олег Анатольевич(73) Патентообладатели Совместное Общество с ограниченной ответственностью БЕЛОРИС Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(57) Способ получения -тироксина, включающий окислительную конденсацию 3,5-дийод-тирозина и 4-окси-3,5-дийодфенилпировиноградной кислоты в присутствии инициатора окисления и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве инициатора используют персульфат аммония и тетраметилендиамин, процесс конденсации проводят в водно-ацетоновой смеси при рН раствора 7,0-7,6, а целевой продукт выделяют путем растворения образовавшегося в результате конденсации продукта в водно-щелочном растворе и последующего осаждения.(56). . . ., 1961. - . 26. - . 1977-1979. РОДИОНОВ В.М. и др. Журнал общей химии. - 1957. - Т. 27. -8. - С. 2234-2238.1064529, 1959.2889363, 1959.0785921 1, 1996. Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу получения гормона щитовидной железы -тироксина (3,3,55-тетрайодтиронин общепринятое обозначение - Т 4). Т 4 является распространенным биохимическим реагентом и субстанцией лекарственных препаратов. Этот гормон входит в состав наборов реактивов для иммуноанализа, которые используются в сфере клинической лабораторной диагностики. Лекарственные препараты на основе Т 4 находят широкое применение при лечении гипотиреозов различной этимологии, в том числе кретинизма, микседемы, первичного гипотиреоза (связанного с функциональной недостаточностью, первичной атрофией, частичным или полным отсутствием щитовидной железы), а также вторичного (гипофизарного) и третичного (ги 5755 1 поталамического) гипотиреозов. Кроме того, Т 4 применяется в онкологии для предотвращения образования и лечения различных типов опухолей, в том числе при раке щитовидной железы. Известны несколько способов синтеза Т 4 1-3. В схеме синтеза Т 4, состоящей из девяти стадий 1, исходными веществами являются 4-метоксифенол и 1,2,3-трийод-5 нитробензол. Из этих соединений на первой стадии получают 2,5-дийод-4-нитро-4 метоксидифениловый эфир, который далее путем ряда химических реакций превращают в рацемический Т 4. Для промышленного получения Т 4 этот способ мало применим, так как предполагает использование дорогостоящих и труднодоступных веществ и реагентов,многостадиен и приводит к рацемическому продукту, разделение которого на антиподы является затруднительным. Схема получения Т 4 из -тирозина, описанная в работе 2, включает восемь стадий, и общий выход Т 4 составляет 26 . Ключевой стадией этой схемы является синтез производного дифенилового эфира при взаимодействии п-метоксифенола и этилового эфира ацетил-3,5-динитротирозина в присутствии п-толуолсульфохлорида и пиридина. Этот способ имеет ряд недостатков многостадийность, большие затраты реагентов, использование взрывоопасных соединений. Известна семистадийная схема синтеза Т 4 3, согласно которой получение производного дифенилового эфира осуществляют при взаимодействии 4,4-диметоксидийодоний йодида (или бромида) с этиловым эфиром -ацетил-3,5-дийодтирозина. Следует отметить, что 4,4-диметоксидийодоний йодид, как и другие йодониевые соединения, может быть взрывоопасным, а его получение протекает с невысоким выходом (12-47 ). Другие стадии в данной схеме также характеризуются низкими выходами и длительностью протекания процессов. Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ, описанный в работе 4. Главной стадией этой схемы является окислительная конденсация 3,5-дийодтирозина(одно из общепринятых обозначений - 2 Ту) и 4-окси-3,5-дийодфенилпировиноградной кислоты (наше обозначение - (2 ОФ)-ПВК) с образованием Т 4. (2 ОФ)-ПВК получают кислотным гидролизом 4-(4-ацетокси-3,5-дийодбензаль)-2-метил-5-азлактона, который в свою очередь получают двумя вариантами способа. В первом варианте используют в качестве базового соединения 2 Ту, который превращают в -хлорацетильное производное,а затем обрабатывают уксусным ангидридом и пиридином с получением азлактона. Во втором варианте исходным соединением служит 4-окси-3,5-дийодбензальдегид, который переводят в азлактон конденсацией с -ацетилглицином. Конденсация (2 ОФ)-ПВК и 2 Ту протекает при участии кислорода и включает элиминирование остатка пировиноградной кислоты (-СН 2 СОСООН), очевидно, через промежуточное образование дийодоксифенильного радикала. Ниже приведены два примера конкретного выполнения способапрототипа. К суспензии 2,17 г (4,64 ммоль) 2 Ту дигидрата в смеси 50 мл 0,2 М боратного буфера(рН 7,6), 17,5 мл насыщенного раствора 2 О и 17,5 мл 0,1 н.добавляют 4 н. НС до установления рН 7,6, а затем приливают 25 мл хлороформа. Через смесь интенсивно пропускают кислород и одновременно прибавляют 1,8 г (4,16 ммоль) (2 ОФ)-ПВК порциями по 80 мг с интервалами 5 мин в течение 1,75 ч, поддерживая рН в диапазоне 7,4-7,8. После завершения прибавления (2 ОФ)-ПВК смесь продолжают перемешивать в течение 10-15 мин. Хлороформ удаляют в вакууме. Из остатка отфильтровывают 750 мг сырого целевого продукта. Выход - 23(в расчете на взятое количество (2 ОФ)-ПВК). Во втором примере используют инициатор окислительной конденсации, хлороформ в реакционной смеси заменяют на н-бутанол, в котором растворяется и вносится (2 ОФ)ПВК в избытке по отношению к 2 Ту. Конкретно, смесь 2,17 г (4,64 ммоль) 2 Ту дигидрата,50 мл 0,2 М боратного буфера (рН 7,6), 17,5 мл насыщенного раствора 24 и 17,5 мл 0,1 н.подкисляют 4 н. НС до рН 7,6. В реакционный сосуд вносят 0,1 г гидропере 2 5755 1 киси третбутила (содержит около 10 активного кислорода) в 10 мл н-бутанола, начинают пропускать кислород через интенсивно перемешиваемую смесь и одновременно прикапывают раствор 2,8 г (6,5 ммоль) (2 ОФ)-ПВК в 50 мл н-бутанола в течение 90 мин,поддерживая рН реакционной смеси в диапазоне 7,4-7,8 прибавлением 2 н. . После внесения (2 ОФ)-ПВК смесь перемешивают еще 10 мин. Бутанол удаляют в вакууме и восстанавливают первоначальный объем реакционной смеси добавлением воды. Выпавший осадок фильтруют и промывают водой. Затем осадок растирают с 4 н. НС, фильтруют,промывают водой и сушат. Получено 1,05 г сырого целевого продукта. Выход - 29(в расчете на взятое количество 2 Ту). Недостатками способа-прототипа являются сложность процесса, невысокий выход и низкая чистота целевого продукта. Действительно, окислительную конденсацию 2 Ту и(2 ОФ)-ПВК проводят, используя сложную по составу двухфазную реакционную смесь,которая содержит неорганические компоненты (247, 24, ) в воде и не смешивающиеся с ней органические растворители (до 30 объема смеси). При выделении целевого продукта из этой реакционной смеси обязательной является стадия отгонки органических растворителей в вакууме. Усложняет процесс и длительная процедура прибавления (2 ОФ)-ПВК малыми порциями. Использованием гидроперекиси трет-бутила в качестве инициатора реакции не достигается существенное повышение выхода, который составляет максимум 29 . Описанная в способе-прототипе стадия выделения Т 4 из реакционной среды не дает чистый целевой продукт. Задачей настоящего изобретения является упрощение процесса получения Т 4, увеличение выхода и повышение чистоты целевого продукта. В соответствии с указанной задачей разработан способ получения Т 4, заключающийся в окислительной конденсации 2 Ту и (2 ОФ)-ПВК в водно-ацетоновой смеси в присутствии персульфата аммония и тетраметилендиамина с последующим выделением целевого продукта путем растворения его в водно-щелочном растворе и последующего осаждения. Предпочтительное значение рН водно-ацетоновой смеси равно 7,0-7,6. Выделение и очистку целевого продукта проводят путем растворения образовавшегося в результате реакции осадка при рН выше 12, осаждения при рН 7,0-7,6 и промывки при рН 7,0-7,6 или путем растворения его при кипячении в 2 н. растворе 23, имеющем значение рН 10,5-11,0, и последующего осаждения продукта при кипячении раствора. Способ отличается от прототипа использованием в качестве инициатора окисления персульфата аммония и тетраметилендиамина, проведением процесса в водно-ацетоновой смеси и выделением целевого продукта путем его осаждения из водно-щелочных растворов. Исходный реагент, 2 Ту, является продажным реактивом (, Чехия), а(2 ОФ)-ПВК получают трехстадийным синтезом 4-6. Описание заявляемого способа дано ниже. Стадию окислительной конденсации проводят при рН 7,0-7,6, используя для регулирования кислотности среды боратную, фосфатную или иные буферные смеси с указанным интервалом рН. (2 ОФ)-ПВК вводят в реакцию в виде водно-ацетонового раствора. Реагенты смешивают непосредственно перед началом реакции, которую инициируют добавлением каталитических количеств (4)228 и тетраметилендиамина. Реакцию проводят при постоянном перемешивании, интенсивно пропуская кислород и поддерживая рН в интервале 7,0-7,6. Постепенно в ходе реакции образуется Т 4, который выпадает в осадок. После окончания реакции продукт отделяют фильтрованием и промывают водой. Для его очистки используют осаждение из водно-щелочных растворов по одному из двух способов. По первому из них осадок растворяют в 0,1 н. , избирательно осаждают Т 4 подкислением раствора до рН 7,0-7,6, осадок промывают буфером (рН 7,0-7,6). При необходимости стадию очистки повторяют. Белый осадок высушивают из замороженного состояния (лиофилизуют). Получают белый или светлосерый порошок, который по свойствам соответствует чистому Т 4. 3 5755 1 По второму способу осадок растворяют при кипячении в 2 н. щелочном растворе а 2 СО 3, полученный раствор охлаждают, при этом выпадает осадок целевого продукта,который отделяют фильтрованием, промывают на фильтре водой и сушат в вакууме. Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения, не ограничивающим объема изобретения. Пример 1. Получение -тироксина путем окислительной конденсации 3,5-дийодтирозина и 4 окси-3,5-дийодфенилпировиноградной кислоты. В стакан емкостью 0,5 л вносили 650 мг (1,5 ммоль) 2 Ту, а затем последовательно прибавляли 15 мл 0,1 н. , 40 мл 0,2 М боратного буфера (рН 7,6) и при перемешивании на магнитной мешалке - несколько капель 0,5 н. НС до установления рН 7,4. К полученному мутноватому раствору добавляли раствор 650 мг (1,5 ммоль) (2 ОФ)-ПВК в смеси 15 мл ацетона и 20 мл боратного буфера, вносили около 50 мг персульфата аммония,0,05 мл тетраметилендиамина и тут же начинали пропускать кислород, осуществляя перемешивание на магнитной мешалке. В ходе реакции периодически измеряли рН реакционной среды и поддерживали рН на уровне 7,4 прибавлением по каплям 0,1 н. . Продолжительность пропускания кислорода - 50 мин, последующее перемешивание реакционной среды - 10 мин. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали на фильтре тремя порциями воды по 3 мл. Влажный осадок растворяли в 20 мл 0,1 Ми полученный раствор с рН 12,5 титровали 1 М НС до рН 7,0. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 3000 в течение 5 мин. Влажный осадок суспендировали в 20 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) и центрифугировали суспензию в тех же условиях. Осадок растворяли в 0,1 М(рН 12,5), титровали 1,0 М НС до рН 7,3, центрифугировали образовавшуюся суспензию в тех же условиях, промывали осадок 20 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,3) путем суспендирования и центрифугирования. Осадок белого цвета высушивали в вакууме из замороженного состояния. Масса полученного белого или сероватого порошка составила 550 мг (выход 47 ). Для очистки по второму способу осадок, выпавший из реакционной смеси, отделяли фильтрованием, сушили в течение 30 мин в вакууме и небольшими порциями добавляли к 45 мл кипящего 2 н. раствора 23. Нагревание продолжали до полного растворения осадка, после чего раствор медленно охлаждали до комнатной температуры, помещали его в холодильную камеру и выдерживают при температуре 26 в течение 2-3 часов. Выпавший осадок отделяли фильтрованием и промывали на фильтре водой (24 мл). Целевой продукт лиофилизовали. По данным ТСХ (изопропанол-5 аммиак 41) порошок целевого продукта, полученный после очистки с использованием обоих способов, содержит только один компонент,который по хроматографической подвижности соответствует Т 4. Раствор порошка в 0,1 н.имеет УФ-спектр с максимумом при 325 нм, характерный для Т 4. Радиоиммуноанализ этого раствора показал, что поглощающее в области 315-335 нм вещество на 99 состоит из иммунореактивного Т 4. Продукт дает единственный пик при высокоэффективной жидкостной хроматографии. Физико-химические константы синтезированного Т 4 в сравнении с литературными данными для эталонного Т 4 7 приведены в табл. 1. Структурную идентичность синтезированного Т 4 и природного гормонально активного Т 4 доказывает их одинаковое взаимодействие с моноклональными антителами к Т 4 и с природным Т 4-связывающим глобулином из плазмы крови человека 8. В табл. 2 приведены основные характеристики заявляемого способа и способапрототипа. 5755 1 Таблица 1 Физико-химические характеристики синтезированного продукта и эталонного Т 4 Параметр 1. Температура плавления, С 2. Удельное оптическое вращение, ,(с 0,5 1 М-12 по объему) 3. Хроматографическая подвижность, (ТСХ 53 31) 4. Время удерживания, с (офВЭЖХ, колонка 6 см с силикагелем 18 вода-ацетонитрил (4555), рН 5,5) 5. Максимум УФ-поглощения, ах,нм (раствор в 0,1 н. ) 6. Коэффициент экстинкции при 325 нм,А (0,1 , 1 см), лг-1 см-1 7. Константа ассоциации с моноклональными антителами к Т 4, М-1 10-8 8. Константа ассоциации с природным Т 4 связывающим глобулином, -110-8 Таблица 2 Основные характеристики заявляемого способа и способа-прототипа Характеристика Изобретение Прототип Время реакции, мин 50-60 100-120 Выход Т 4,47 23-29 Чистота Т 4,99 Сырой продукт (80 ) Применение в реакции окислительной конденсации персульфата аммония и тетраметилендиамина позволяет более эффективно по сравнению с используемыми в способепрототипе перекисью водорода и гидроперекисью третбутила инициировать радикальное расщепление (2 ОФ)-ПВК именно в водной среде и при комнатной температуре, сократить время протекания реакции и повысить выход Т 4. Использование ацетона, растворителя недорогого и доступного по сравнению с приведенными в прототипе хлороформом, н-бутанолом и толуолом, позволяет проводить реакцию в гомогенной среде и устранить стадию отгонки растворителя, что особенно важно для промышленного синтеза. В соответствии с изобретением предлагается очистка Т 4 осаждением его из воднощелочных растворов, которая позволяет выделить целевой продукт, содержащий 99 основного вещества по данным двух независимых высокочувствительных и точных методов. В способе-прототипе Т 4 выделяют в виде сырого продукта, чистота которого (около 80 ) контролируется бумажной хроматографией. Таким образом, сравнение основных характеристик заявляемого способа и способапрототипа подтверждает достижение цели изобретения. Источники информации 1.,.. .//. .-1927.-. 21. -1.-. 169-181. 2.,.Т.,.,Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.