Способ получения аденозин-5′-трифосфата

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(73) Патентообладатель Ляховец Владимир Иванович(57) 1. Способ получения аденозин-5-трифосфата, включающий ферментативное фосфорилирование аденозина в присутствии неорганических фосфатов, углеводов, магния хлористого и дрожжей, подкисление до рН 4,54,8, сепарацию реакционной смеси, сорбцию аденозин-5-фосфатов на сильноосновной ионообменной смоле,элюирование аденозин-5-монофосфата и аденозин-5-дифосфата, десорбцию аденозин-5-трифосфата и осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что в процессе фосфорилирования до подкисления проводят предварительную сепарацию реакционной смеси. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительную сепарацию реакционной смеси проводят через 1,5-2 часа от начала реакции фосфорилирования. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что предварительную сепарацию производят путем центрифугирования. 4. Способ по пп.1, 2 и 3, отличающийся тем, что реакцию фосфорилирования проводят при 18-20 С.(56) 1. А.с.СССР 941384, МКИ 07 19/16, 1982. Изобретение относится к биотехнологическому способу получения аденозин-5-трифосфата (АТФ), который находит широкое применение в медицине, биохимии, косметике. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения Ф, включающий ферментативное фосфорилированиев присутствии неорганических фосфатов, углеводов, пивных дрожжей, толуола, калия хлористого, магния хлористого, подкисление до рН 4,5-4,8, сепарацию реакционной смеси путем отфильтровывания дрожжевого шлама, сорбцию нуклеотидов на сильноосновной ионообменной смоле, элюирование АМФ и АДФ, десорбцию АТФ и осаждение целевого продукта (1). Прототип частично устраняет недостатки аналога, повышая выход целевого продукта, за счет утилизации АМФ и АДФ введением в последующий цикл фосфорилирования в качестве источника о. К недостаткам прототипа следует отнести также необходимость использования толуола, что осложняет утилизацию дрожжевой массы и необходимость термостатирования (температура реакции 37 С ). 3 адачей настоящего изобретения является повышение выхода целевого продукта и расширение сырьевой базы путем обеспечения возможности использования в качестве источника А не только чистого коммерческого препарата , н и смесей, содержащих кроме Ао другие нуклеозиды и нуклеиновые основания, а также снижение теплозатрат за счет проведения реакции при комнатной температуре. Поставленная задача решается тем, что в процессе получения АТФ, включающем ферментативное фосфорилирование аденозина в присутствии неорганических фосфатов, углеводов, магния хлористого и дрожжей,1 1651 1 подкисление до рН 4,5-4,8, сепарацию реакционной смеси, сорбцию нуклеотидов на сильноосновной ионообменной смоле, элюирование АМФ и АДФ, десорбцию АТФ и осаждение целевого продукта, в процессе реакции фосфорилирования, до подкисления производят предварительную сепарацию реакционной смеси через 1,5-2 часа от начала реакции фосфорилирования, причем предварительную сепарацию производят путем центрифугирования, а реакцию фосфорилирования проводят при 18-20 С. Предварительная сепарация реакционной смеси в процессе фосфорилирования позволяет, за счет осаждения дрожжевых клеток, сдвинуть равновесие реакции фосфорилирования в сторону большго накопления АТФ, а снижение температуры реакции фосфорилирования до комнатной - уменьшить образование дезаминированного побочного продукта - инозина ( по). Используемая нами ферментативная система дрожжей способна эффективно фосфорилировать из природных нуклеозидов только аденозин, поэтому присутствие других нуклеозидов, а также нуклеиновых оснований в реакционной среде не приводит к образованию других нуклеотидов. Последнее позволяет нарабатывать АТФ как из смеси четырех нуклеозидов, получаемых, например, при нуклеозидном гидролизе РНК, так и после частичного или полного отделения аденозина от сопутствующих нуклеозидов. Ферментативное фосфорилирование аденозина (как единственного нуклеозида в реакционной смеси, так и в смеси с другими нуклеозидами и нуклеиновыми основаниями) в присутствии неорганических ортофосфатов, углеводов, дрожжей и магния хлористого завершается подкислением до рН 4,5 и охлаждением. Нуклеотиды (аденозин-5-фосфаты) сорбируют на сильноосновном ионообменнике с последующим элюированием аденозин-5-монофосфата и аденозин-5-дифосфата 0,02 Н хлористым натрием в 0,01 Н соляной кислоте,АТФ десорбируют 0,5 Н хлористым натрием в 0,02 Н соляной кислоте. Целевой продукт осаждают из элюата этиловым спиртом, очищают и выделяют известным методом. Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения. Пример 1. Клетки очищенной культуры пекарских дрожжейвыращивали в колбах Эрленмейера или в ферментере на среде следующего состава КН 2 РО 4 - 8 472 - 2 (4)24 - 8 меласса - 60 дрожжевой автолизат - 4 г/литр, при 30 С и рН 5,0-5,5. Аэрация в колбах Эрленмейера осуществлялась на качалке с режимом работы 220 об./мин, в ферментере - из расчета 1 литр воздуха на литр среды в минуту. Через 8 часов инкубации клетки осаждали центрифугированием, отмывали 0,9 раствором хлористого натрия и собирали центрифугированием при 2000-3000 . Дрожжевую пасту распределяли слоем до 3 мм толщиной и сушили при комнатной температуре 48-72 часа. Для проведения реакции использовали порошок высушенных дрожжей. К 100 мл 0,143 М калий фосфатного буфера, рН 6,9 добавляли 1,43 ги 2,4 г сахарозы. После их растворения добавляли 10,7 г сухого дрожжевого порошка и 0,7 мл 1 М хлористого магния. Реакцию вели при температуре 202 С с перемешиванием в течение 100 минут, затем производили предварительное сепарирование реакционной смеси центрифугированием при 4000-5000 в течение 5 минут (процесс центрифугирования может быть заменен фильтрацией, если время ее проведения не превышает 20 мин). Надосадочную жидкость через 90 минут после центрифугирования закисляют до рН 4,5 добавлением 2,9 мл ледяной уксусной кислоты. Реакционная смесь в конце реакции фосфорилирования в оптимизированных по времени предварительного сепарирования (табл., вариант 2) имела следующий нуклеиновый состав (в мол. ) АТФ - 87 АДФ - 2,7 АМФ 1,5 Инозин - 8,8. Проведение реакции фосфорилирования без предварительного сепарирования или с сепарированием, но в другие, неоптимальные сроки приводит к образованию другого нуклеинового состава, в котором АТФ достигает меньших значений (табл.). Выпавший после закисления осадок отделяли центрифугированием при 5000-7000 в течение 10 минут, отмывали и переосаждали в 100 мл охлажденной дистиллированной воды и удаляли. Объединенные надосадочные жидкости, содержащие целевой продукт, разбавляли 200 мл дистиллированной воды и наносили на охлаждаемую колонку диаметром 1,7 см, заполненную анионитом АРА-5 П в С- - форме,высотой слоя 9 см, объемом - 20 мл, со скоростью 85 мл/час. После сорбции колонку промывали водой, АМФ и АДФ элюировали раствором 0,02 Н хлористого натрия в 0,01 Н соляной кислоте, объемом - 1,5 л. Десорбцию АТФ проводили раствором 0,5 Н хлористого натрия в 0,02 Н соляной кислоте, следя за ходом элюции по оптической плотности при 254 Нм. АТФ из полученной фракции осаждали с помощью этилового спирта и перекристаллизовывали в виде динатриевой соли АТФ из раствора, имеющего значение рН 2,3 и содержащего хлористый натрий, добавлением одинакового объема этилового спирта. Выделяли 1,93 г продукта динатриевой соли АТФ, чистотой 97. Пример 2. В примерах 2, 3, 4 использовался нуклеозидный гидролизат РНК, полученный ферментативным расщеплением с помощью мицелия несовершенного гриба. 1651 1 К 100 мл нуклеозидного гидролизата РНК, рН 6,8, содержащим 158 мг аденозина, добавляли 0,24 г глюкозы, 0,83 мл 1 М калий фосфатного буфера, рН 6,9, 1,15 г сухих дрожжей (полученных и подготовленных, как описано в прим.1) и 86 мкл 1 М 2. Реакцию вели при комнатной температуре с перемешиванием и через 2 часа от начала реакции проводили предварительное сепарирование реакционной смеси центрифугированием при 5000 в течение 5 минут. Продолжали реакцию, не удаляя осадок и без перемешивания 2,5 часа при той же температуре. Общее время реакции 4,5 часа. Состав аденозин-5-фосфатов после фосфорилирования (в мол. ) АТФ - 82,4 АДФ - 11,8 АМФ- 5,8. Их суммарное количество соответствует исходному содержанию аденозина. Пример 3. Из гидролизата РНК, после отделения фильтрованием выпавшего в осадок гуанозина (90 от его исходного количества) с концентрацией аденозина, доведенной до величины 15,8 мг/мл, отбирали 10 мл и добавляли необходимые компоненты аналогичного состава и количества (как в прим.2), и вели реакцию при такой же температуре с предварительной сепарацией реакционной смеси через 2 часа от начала реакции. Общее время реакции 4,5 часа. Состав аденозин-5-фосфатов после завершения реакции фосфорилирования (в мол.) АТФ - 85,7 АДФ 9,2 АМФ - 5,1. Их суммарное количество соответствует исходному содержанию аденозина. Пример 4. Фракция, содержащая аденозин и цитидин, получаемая пропусканием нуклеозидного гидролизата РНК че рез колонку с сильноосновным ионообменником -17 в О- форме и вымываемая водой, упаривалась до конечной концентрации аденозина 15,8 мг/мл. К 10 мл этого раствора добавляли 1,5 мл 1 М ортофосфорной кислоты, нейтрализующей щелочной концентрат до рН 6,8 (при необходимости значение рН корректируется 1 Н КОН или 1 Н Н). В полученный раствор добавляли 0,24 г глюкозы, 1,15 г сухих дрожжей и 85 мкл 1 М магния хлористого. Реакцию проводили при комнатной температуре (18-22 С) с перемешиванием в течение 2 часов, смесь центрифугировали при 5000 в течение 5 минут и продолжали реакцию без перемешивания при такой же температуре в течение 2 часов. Общее время реакции фосфорилирования 4 часа. Состав аденозин-5-фосфатов после фосфорилирования (с мол. ) Ф - 83,4 АДФ - 10,2 Ф - 6,4. Их общее количество соответствует исходному количеству аденозина. Выделение Ф в вариантах, описанных в примерах 2, 3, 4 не проводилось. Приложение к прим.1. Оптимизация времени проведения предварительного сепарирования реакционной смеси по выходу АТФ(представлен нуклеиновый состав реакционной смеси в мол. ).варианта Общее время реакции (мин) Время до пр. сепарации Время после пр. сепарации по АМФ АДФ АТФ