Штамм бактерий Escherichia coli БИМ В-458 – продуцент лизил-тРНК-синтетазы

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бурко Дина Васильевна Квач Сергей Вячеславович Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) БУРКО Д.В. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных трудов. Т. 1.- Минск, 2007.- С. 109-117. КВАЧ С.В. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук, 2006.-5.- С. 82-84... .1992.- . 74.- . 6.- . 581-584...., 2006.- . 273 15.- . 3534-3544.(57) Штамм бактерийБИМ В-458 - продуцент лизил-тРНК-синтетазы. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штаммБИМ В-458 Д - продуцент лизил-тРНК-синтетазы, которая способна трансформировать аденозин-5-трифосфатв диаденозинтетрафосфат (4) формулы 2 Указанное соединение является биологически активным и может быть использовано в медицине для профилактики и лечения тромбозов, контролируемой гипотензии, ускорения заживления ран 1-3. 13343 1 2010.06.30 Известны штаммы бактерий-12 и 788 4,103 5,-1503 6, продуцирующие аминоацил-тРНК-синтетазы и применяемые для ферментативного получения 4. Общим недостатком перечисленных штаммов является низкая активность в отношении аминоацил-тРНК-синтетаз, так как они получены стандартными методами микробиологической селекции и их клетки содержат одну копию гена, кодирующего ту или иную аминоацил-тРНК-синтетазу. Известен рекомбинантный штамм бактерий 2(5), продуцирующий лизил-тРНК-синтетазу и использующийся для получения 4 7. Данные по активности штамма в отношении рекомбинантной лизил-тРНК-синтетазы (в ед. активности/мл культуральной жидкости, мг белка или биомассы клеток) в работе не приведены. Продуцирующая способность штамма (количество 4, которое можно получить, затратив 1 г клеточной биомассы или 1 л культуральной жидкости) при использовании для получения 4 составляет 0,376 г продукта/г клеток или 3,4 г продукта/л культуральной жидкости. Недостаток указанного штамма состоит в его относительно низкой продуцирующей способности при использовании для получения 4. Из известных штаммов-продуцентов лизил-тРНК-синтетазы, применяемых для биокаталитического получения 4, наиболее близким по эффективности к предлагаемому штамму является штамм 2 8 (прототип). Активность лизил-тРНКсинтетазы в ультразвуковом лизате клеток штамма-прототипа составляет 42,4 ед./г бактериальных клеток или 159,4 ед./л культуральной жидкости. При использовании штамма-прототипа для получения 4 в ультразвуковой лизат клеток вносят сульфат аммония (50 насыщения), образовавшийся осадок лизил-тРНКсинтетазы подвергают сорбционной хроматографии на колонке с кальций-тартратным гелем и гельфильтрации на колонке с гелем-55. Продуктивность штамма-прототипа в реакции синтеза 4 изсоставляет 0,64 г Ар 4 А/г клеток или 2,4 г Ар 4 А/л культуральной жидкости. Штамм-прототип получен трансформацией 21(3) рекомбинантной плазмидой 24, в которую встроен ген , кодирующий аминокислотную последовательность стресс-индуцибельного изофермента лизил-тРНК-синтетазы. Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая активность лизилтРНК-синтетазы и продуцирующая способность в отношении синтеза 4. Задачей предлагаемого изобретения является получение нового штамма бактерий-12 - более продуктивного штамма-продуцента лизил-тРНК-синтетазы с повышенной продуцирующей способностью его клеток в отношении синтеза 4 из . Источником структурного гена , кодирующего аминокислотную последовательность лизил-тРНК-синтетазы, служила хромосомная ДНК штамма бактерий 5. ДНК выделили с помощью фенол-хлороформного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона. Генсинтезировали с помощью ПЦР, используя -полимеразу (, США) и синтетические олигонуклеотидные праймерыи . Продукты амплификации разделили путем электрофореза в 1 -ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену , выделяли и лигировали в вектор(, США), рестрицированный по - и сайтам и обработанный щелочной фосфатазой. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки 5, полученные стандартным кальциевым методом 9, с последующим высевом на плотную питательную среду(1 триптон, 0,5 дрожжевой экстракт, 1),содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Из пяти выросших одиночных колоний выделили плазмиды, которые анализировали на наличие вставки генаметодом 2 13343 1 2010.06.30 ПЦР, используя праймер к Т 7-промотору , входящему в состав плазмиды , и праймер к гену- . Колонии, содержащие плазмидусо вставкой гена ,перенесли в колбы, содержащие 25 мл средыс ампициллином, и культивировали 12 ч. Из полученных биомасс выделили плазмиды стандартным щелочным методом 9. В результате была получена плазмида (названная ), несущая генв правильной ориентации. Путем последующей трансформации плазмидойклеток 21(3) был получен рекомбинантный штамм-12 с повышенной дозой гена . От штамма-прототипа штамм-12 отличается тем, что в составе вектораструктурная часть гена лизил-тРНК-синтетазы удлинена на 6 гистидиновых кодонов. Такая структура вектора позволяет существенно упростить процедуру очистки фермента с помощью металло-аффинной хроматографии (на никельсодержащих сорбентах). Штамм-12 депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологииБеларуси под коллекционным номером БИМ В-458 Д и характеризуется следующими свойствами. Генотип., , , , , (3) 9. Клетки содержат плазмидусо встроенным геном , кодирующим лизил-тРНК-синтетазу, в рамке считывания которого расположены дополнительные нуклеотиды, и геном , детерминирующим устойчивость клеток к ампициллину. Морфологические признаки. Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5)(2,0-6,0) мкм подвижные, перитрихальное жгутикование грамотрицательные. На МПА и агаризованной среде Адамса (30 С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Растет на простых питательных средах, содержащих ампициллин в количестве 25100 мкг/мл. Диапазон температуры роста бактерий 8-40 С с оптимумом 37 С. рН-оптимум роста находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб. Клетки-12 могут в качестве единственного источника углерода использовать ацетат, но не цитрат. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют 2 на железо-сахарной среде, не сбраживают лактозу и малонат, не гидролизуют желатин. На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (-форма). Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл). Содержание ГЦ в составе ДНК 55,40,4 мол.(определено оптическим методом). Клетки-12 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике (4-6 С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный бульон, среда Хоттингера), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 -ное обезжиренное молоко) состоянии. Клетки-12 продуцируют рекомбинантную лизил-тРНК-синтетазу и благодаря этому обладают способностью катализировать синтез 4 из . Фермен 3 13343 1 2010.06.30 тативная активность ультразвукового лизата клеток, измеренная в реакции синтеза 4,составляет 106,6 ед./г или 458,3 ед./л культуральной жидкости. Продуцирующая способность штамма в реакции синтеза 4 изсоставляет 1,5 г Ар 4 А/г клеток или 6,1 г Ар 4 А/л культуральной жидкости. Для культивирования-12 применяют питательную среду(рН 7,0), приготовленную на дистиллированной воде, следующего составатриптон ( США) - 1,0 дрожжевой экстракт ( США) - 0,5- 1,0. Ампициллин - 100 мкг/мл. Культивирование проводят до оптической плотности 0,6 (600 нм), затем индуцируют синтез белка путем внесения изопропилтиогалактопиранозида до концентрации 1 мМ и продолжают культивирование в течение последующих 5 ч. Изменение биомассы бактерий контролируют турбодиметрически (600 нм), используя соответствующую калибровочную кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при 8 000 в течение 10 мин и дважды отмывают от питательной среды с помощью 0,15. Для определения активности штамма в отношении лизил-тРНК-синтетазы 30 -ную суспензию клеток, содержащую 0,15, обрабатывают ультразвуком при мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин при температуре 2-4 С. Остатки разрушенных клеток отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 8000 . Реакционную смесь (1 мл), содержащую (мМ) хлорид магния - 10, хлорид цинка 0,16, буфер - (рН 7,5) 10 - 20,- 4,3, -лизин - 2,4, 0,5 ед. пирофосфатазы(, Германия) и 1 мкл лизата клеток, инкубируют при 37 С при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии в системе диоксан-вода-25 -ный аммиак (641). За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает образование 4 в количестве 1 мкмоль за 1 мин. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался в качестве продуцента лизил-тРНК-синтетазы и для получения 4. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. Культивирование-12. Культивирование-12 проводят в 4-х колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих по 50 мл питательной среды, на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 37 С. Питательная среда приготовляется на дистиллированной воде и имеет следующий состав(рН 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 атм, 15 мин. После стерилизации в среду вносят ампициллин до концентрации 100 мкг/мл. В процессе культивирования проводят измерение оптической плотности культуры при 600 нм. При достижении оптической плотности 0,6-1 в среду вносится стерильный изопропилтиогалактопиранозид до концентрации 1 мМ и культивирование продолжается в течение последующих 5 ч. По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 8 000 в течение 10 мин и дважды отмывают от питательной среды 0,15 раствором . Получают клеточную биомассу в количестве 4,3 г. Лизил-тРНК-синтетазная активность выращенной культуры составляет 106,6 ед./г клеток или 458,3 ед./л культуральной жидкости. Пример 2. Использование штамма-12 для получения 4. 1,0 г клеток, полученных как в примере 1, суспендируют в 2,5 мл буфера, содержащем 50 мМ 24, 300 мМ , 10 мМ имидазол (рН 8,0), и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов -10 (, Польша) при мощности 0,5 кВт в те 4 13343 1 2010.06.30 чение 5 мин при 4 С. После центрифугирования образца в течение 30 мин при 20000 из полученного супернатанта выделяют лизил-тРНК-синтетазу, используя одностадийную аффинную хроматографию на смоле - (, США) по методике фирмыпроизводителя 11. Полученную лизил-тРНК-синтетазу вносят в реакционную смесь (конечный объем 1,0 л), содержащую (мМ) хлорид магния - 10, хлорид цинка - 0,16, буфер - (рН 7,5) - 20,- 4,3, -лизин - 2,4, 250 ед. пирофосфатазы, и инкубируют при 37 С в течение 3,5 ч. В этих условиях выход реакции достигает 95 от теоретически возможного. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси путем хроматографии на колонке со смолой -32 (, Англия) с использованием линейного градиента бикарбоната аммония (РЕАХИМ, Украина) (100 до 400 мМ). Элюат выпаривают досуха на роторном испарителе при 55 С. Осадок промывают охлажденным спиртом и высушивают под вакуумом. Получают 1,5 г хроматографически чистого 4. Таким образом, выход изолированного целевого продукта в расчете на исходныйсоставляет 80 от теоретически возможного. Элементный состав, хроматографическая подвижность при хроматографировании на тонкослойных пластинкахфирмы Сорбиополимер (Россия) в системе растворителей диоксан-вода-25 аммиак (641), а также параметры УФ- и ПМР-спектров целевого продукта совпадали с соответствующими характеристиками заведомо известного образца - 4 (, США). Продуцирующая способность штамма-12 в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице. Сравнение продуцирующей способности предлагаемого и известных рекомбинантных штаммов микроорганизмов, применяющихся для получения 4 Штамм микроорганизмов Ар 4 А-продуцирующая способность штамма г 4/г клеток г Ар 4 А/л культуральной жидкости-12 1,5 6,1 Источник информации Предлагаемое техническое решение 8 7- данные отсутствуют. Из данных таблицы следует, что Ар 4 А-продуцирующая способность штамма-12 значительно выше любого из известных штаммов, применяющихся для получения этого продукта. Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению со штаммом-прототипом значительно более высокой активностью лизил-тРНК-синтетазы, выраженной как в ед. акт./г клеток (106,6 против 42,4), так и в ед. акт./л культуральной жидкости (458,3 против 159,4) 5 13343 1 2010.06.30 повышенной продуцирующей способностью при использовании для получения 4 1,5 г 4/г клеточной биомассы (против 0,64) и 6,1 г 4/л культуральной жидкости(против 2,4) более простой процедурой использования для получения 4. Источники информации 1. Патент США 5049550, МПК А 61 К 031/70, 1991. 2..,.,.,.,.(4-1500)//. .1999.- . 43.- . 82-86. 3..,.,.,.// . . .- 2004.- . 24.- . 3.- . 186-193. 4. Патент США 4886749, МПК 12 19/00, 1989. 5..,.,.,.,.. .- 1987.- . 146.- . 1.- . 173-178. 7..,.,., - .,..5,5-1, 4- (4)// . . .,. 1.- 1996.- . 16.- . 2009-2019. 8. Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. Применение генно-инженерной лизил-тРНКсинтетазыв реакции синтеза диаденозин-5,5-Р 1,Р 4-тетрафосфата. Микробная биотехнология фундаментальные и прикладные аспекты Сб. науч. тр. Т. 1 / Под ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. - Минск Новапринт, 2007. - С. 109-117. 9..,.,Т./ 2- ., 1989. - 2222 . 10. Досон ., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. 3-е изд.- . Мир, 1991.- 361 с. 11. /////./-6- . 12..,.,.,.,. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6