Штамм бактерий Escherichia coli, продуцирующий нуклеозидфосфотрансферазу Erwinia herbicola

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Квач Сергей Вячеславович Ерошевская Людмила Анатольевна Зинченко Анатолий Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56) КВАЧ С.В. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси, 2006,т.50,2, с. 59-63. КВАЧ С.В. Биосинтез, свойства и применение нуклеозидфосфотрансферазыБИМ В-345 для получения нуклеозид-5-монофосфатов. Автореферат диссертации. Минск,2006, с. 2, 14-16. КВАЧ С.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Международной конференции. Минск, 2004, с. 70-72... ,2001, .92, 1, . 50-54.(57) Штамм бактерийБИМ В-435 Д - продуцент нуклеозидфосфотрансферазы. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генной инженерии, и решает задачу получения нового высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента нуклеозидфосфо-трансферазы (НФТ). Этот фермент способен трансформировать нуклеозиды в соответствующие нуклеозид-5-монофосфаты 1, 2 и в связи с чем может быть использован для получения фармсубстанций кардиологических (АМФ), противовирусных (ара-АМФ) и противоопухолевых (2-фтор-ара-АМФ) лекарственных препаратов. Известен штамм бактерий 47/3, полученный при помощи методов микробиологической селекции и продуцирующий НФТ в количестве 9,8 ед./мг клеток 3. Недостатком указанного штамма является низкая продуктивность в отношении НФТ. Известен также штамм 5. Продуцирующая способность штамма в отношении НФТ составляет 1072 ед./мг клеток 4. Недостатком этого штамма является сравнительно невысокая активность НФТ. Из известных штаммов-продуцентов НФТ наиболее близким по активности к предлагаемому является штамм 109 100 (прототип). Штамм-прототип получен трансформацией 109 рекомбинантной плазмидой 19, в ко 11916 1 2009.06.30 торую встроен ген НФТ, изолированный с помощью ПЦР из хромосомной ДНК патогенной бактерии 5. Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая активность НФТ,составляющая 1750 ед./мг клеток. Настоящее изобретение решает задачу получения штаммаНФТ 15 более продуктивного бактериального штамма-продуцента НФТ. Источником структурного гена , кодирующего аминокислотную последовательность НФТ, служила хромосомная ДНК бактерии 47/3. Эту ДНК подвергли частичной рестрикции с помощью эндонуклеазы 3. Полученные фрагменты ДНК фракционировали при помощи агарозного гель-электрофореза и адсорбционной хроматографии на колонке с силикагелем и лигировали в предварительно линеаризованную и дефосфорилированную плазмиду. Смесью полученных плазмид трансформировали компетентные клетки 5, полученные стандартным кальциевым методом 6 с последующим высевом на плотную питательную среду. При скрининге 60 тысяч трансформантов отобран рекомбинантный штаммНФТ 15, проявивший максимальную продуктивность в отношении НФТ. Средадля селекции (рН 7,2) имела следующий состав 7 Триптозный агар (, США) - 3,0 Фенолфталеиндифосфат (, Германия) - 0,1 Метиловый зеленый (, Германия) - 0,005 . Бактерии, обладающие высоким уровнем НФТ-активности, детектировались визуально по ярко-зеленой окраске колоний. Отобранные клоны выращивали глубинным способом на -среде, имеющей состав,триптон ( США) -1,0 дрожжевой экстракт( США) - 0,5- 1,0), с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С в течение 24 ч и анализировали на НФТ-активность. Штамм-продуцентНФТ 15 отличается от штамма-реципиента 5 наличием нескольких копий рекомбинантной плазмиды, в которую лигирован ген , ответственный за синтез НФТ. В качестве генетического маркера эта плазмида содержит ген -лактамазы, придающей клеткам, трансформированным плазмидой, устойчивость к пенициллиновым антибиотикам. КлеткиНФТ 15 проявляют способность к суперпродукции НФТ, которая накапливается в клетках в количестве более 10 от суммарного белка бактерий. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-435 Д и характеризуется следующими свойствами. Генотип.-, 1, 17 (-), 44, -1, 1, , 1, 169 (8015) , 1989. Клетки содержат плазмидусо встроенными генами НФТ и -лактамазы, детерминирующей устойчивость клеток к пенициллиновым антибиотикам. При анализе плазмиды, выделенной из клеток штаммаНФТ 15 с помощью рестрикционных эндонуклеаз, были получены следующие данные а) вставка, содержащая в себе ген, кодирующий НФТ, имеет размер 4 000 пар оснований б) вставка содержит в себе сайты рестрикции(на расстоянии 820 пар оснований от 5-конца вставки),(на расстоянии 850 пар оснований от 5- конца вставки) и двух сайтов(расположение не определено). Морфологические признаки. Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5)(2,0-6,0) мкм подвижные, перитрихальное жгутикование грамотрицательные. 2 11916 1 2009.06.30 На МПА и агаризованной среде Адамса (30 С, 3 сут.) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Растет на простых питательных средах, содержащих ампициллин в количестве 60125 мкг/мл. Диапазон температуры роста бактерий - 8-40 С с оптимумом - 25-30 С. рН-оптимум роста находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб. КлеткиНФТ 15 могут использовать ацетат, а цитрат не используют в качестве единственного источника углерода. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют 2 на железо-сахарной среде, не сбраживают лактозу и малонат, не гидролизуют желатин. На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (-форма). Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл). Содержание ГЦ в составе ДНК 56,30,5 мол.(определено оптическим методом). КлеткиНФТ 15 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике (4-6 С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный бульон, среда Хоттингера), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 -ное обезжиренное молоко) состоянии. КлеткиНФТ 15 после разрушения обладают способностью синтезировать пуриновые и пиримидиновые нуклеозид-5-монофосфаты из соответствующих нуклеозидов и -нитрофенилфосфата. НФТ-активность клеток, измеренная в реакции синтеза АМФ из аденозина составляет 2200 ед./мг клеток. Содержание НФТ в клетках штаммаНФТ 15 составляет до 10 от суммарного содержания белка и фермент после разрушения клеток, например, ультразвуком может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами. Для культивированияНФТ 15 с целью получения НФТ применяют питательную среду(рН 7,0), приготовленную на водопроводной воде, следующего составатриптон ( США) - 1,0 дрожжевой экстракт ( США) - 0,5- 1,0. Культивирование бактерий проводят на орбитальной биологической качалке при частоте оборотов платформы 170-190 об/мин и температуре 37 С в течение 14-15 час в колбе Эрленмейера на 250 мл, содержащей 50 мл питательной среды. За ростом биомассы бактерий следят турбодиметрически (600 нм), используя соответствующую калибровочную кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 М раствороми разрушают ультразвуком. Для этого суспензию (100 мл) клеток (3,6 по сухой биомассе) в 50 мМ Трисбуфере (рН 7,0), содержащем 0,15, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов -10 (фирмаПольша) при мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15000 . Активность НФТ в ультразвуковом лизате клеток определяли по скорости синтеза АМФ из аденозина при использовании в качестве донора фосфата -НФФ. Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержала (мМ) аденозин - 30, -НФФ -60, -ацетатный буфер 3(рН 4,5) - 0,1 и 0,1 мл ультразвукового лизата клеток. Смесь инкубировали при 45 С при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии сначала в системе хлороформ - 96 этанол (41), затем в системе изо-пропанол - вода - 25 -ный аммиак (722). За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает образование АМФ в количестве 1 нмоль за 1 мин в указанных выше условиях реакции. Активность штаммаНФТ 15 в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице. Сравнение активности предлагаемого и известных штаммов микроорганизмов Активность НФТ Источник инфорШтамм мации ед./мг клеток отн.НФТ 15 Предлагаемое 2200 100 решение 47/3 9,8 0,4 35 1072 48,7 4109 100 1750 79,5 5 Из данных таблицы следует, что эффективность штаммаНФТ 15 значительно выше любого из известных штаммов-продуцентов НФТ. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения НФТ. Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения. Пример 1 КультивированиеНФТ 15 в оптимальных условиях. КультивированиеНФТ 15 проводят в колбе Эрленмейера объемом 250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 37 С в течение 15 ч. Питательная среда (50 мл) для выращивания приготовляется на водопроводной воде и имеет следующий составтриптон - 1,0 дрожжевой экстракт - 0,5- 1,0 (рН 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 ати, 15 минут. По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 М раствороми разрушают ультразвуком. Для этого клетки суспендируют в 50 мл 50 мМ Трис-НС 1-буфера (рН 7,0),содержащего 0,15, и обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов -10 фирмы(Польша) при мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15000 . Полученный супернатант используют в качестве источника НФТ. Активность НФТ, определенная, как описано выше, составляет 2200 ед./мг клеток. Пример 2 Получение сухого препарата НФТ. Влажные клетки (10 г)НФТ 15, полученные в условиях примера 1, суспендируют в 20 мл Трис-НС 1-буфера (рН 7,0), содержащем 0,15, и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов -10 фирмы(Польша) при мощности 0,5 кВт в течение 3-5 мин. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 10000 и получают супернатант с содержанием фермента до 10 от суммарного белка клетки. К охлажденному супернатанту приливают тонкой струйкой при перемешивании охлажденный до -18 С ацетон до 60 от конечного объема. После формирования осадка при 4 С в течение 30 мин, его осаждают центрифугированием при 5000(5 мин), высушивают под 4 11916 1 2009.06.30 вакуумом и растирают в фарфоровой ступке. Получают 0,2 г тонко дисперсного порошка с активностью 15000 ед./мг препарата. НФТ в составе сухого препарата может храниться при 4-6 С (бытовой холодильник) без существенной потери активности не менее 1 года. Пример 3 Использование НФТ, продуцируемой штаммомНФТ 15, для синтеза противовирусного нуклеотида - аденинарабинозид-5-монофосфата. НФТ в количестве 26000 ед., полученную, как в примере 1, вносят в реакционную смесь (конечный объем 0,2 л), содержащую (мМ) аденинарабинозид - 10, -нитрофенилфосфат - 30, -ацетатный буфер (рН 4,75) - 100, а также 1 полиэтиленгликоль-6000,инкубируют при 45 С в течение 4 ч. В этих условиях выход реакции достигает 5055 мол.в расчете на исходный аденинарабинозид. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси путем ионообменной хроматографии на колонке со смолой 12 в форме (25140 мм). Непрореагировавший аденинарабинозид элюируют водой, а аденинарабинозид-5-монофосфат-20 мМ . Элюаты продуктов выпаривают досуха на роторном испарителе при 30 С. Осадки промывают охлажденным ацетоном и высушивают под вакуумом. Получают 0,33 г хроматографически чистого аденинарабинозид-5-монофосфата (в расчете на кислоту) и 0,26 г возвращенного из реакции аденинарабинозида. Таким образом, выход аденинарабинозид-5-монофосфата в расчете на затраченный аденинарабинозид составляет 94 мол. . Структура целевого продукта подтверждена сравнением его хроматографической подвижности, а также УФ-спектра с соответствующими характеристиками заведомо известного образца. В частности, при хроматографировании на тонкослойных пластинках-254 фирмы(Германия) в системе растворителей изо-пропанол-водааммиак (722) подвижность целевого продукта совпадала сзаведомо известного образца аденинарабинозид-5-монофосфата. УФ-спектр (рН 7),нм 259 макс (14800) (рН 13),нм 260 макс (15600). Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известным штаммомпродуцентом НФТ значительно более высокой продуктивностью (2200 ед. акт./мг клеток против 1072 ед. акт./мг клеток). Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов НФТ. Источники информации 1.,,,5- // . . - 2004. . 26,24. - . 1847-1850. 2.,,,,,.- // . . - 2007. - . 29,4. - . 585-591. 3. Квач С.В., Барай В.Н., Зинченко А.И. Влияние некоторых факторов на продуцирование нуклеозидфосфотрансферазы 47/3 // Матер. международ. конф. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии,Минск, 26-28 мая 2004. - С. 74-76. 4. Квач С.В., Шахбазов А.В., Ярмолинский Д.Г., Картель Н.А., Зинченко А.И. Получение рекомбинантной нуклеозидфосфотрансферазыи ее применение для синтеза аденинарабинозид-5-монофосфата // Доклады НАН Беларуси. - 2006. - Т. 50,2. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6