Штамм бактерий Escherichia coli-продуцент пуриннуклеозидфосфорилазы

(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Квач Сергей Вячеславович Ерошевская Людмила Анатольевна Зинченко Анатолий Иванович Шахбазов Антон Валерьевич Картель Николай Александрович(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56)... . - 2001. . 22. - . 2 - . 180-188.2239656 С 2, 2004.20030059870 А 1.2003339384 . ДУДЧИК Н.В. Получение штаммовс повышенной продукцией нуклеозидфосфорилаз и их использование при синтезе нуклеозидов. Автореф. дис. - Минск, 1992. - . 7-14,16, 19-20. ТАРАН С.А. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 2008. - Т. 44, 2. - . 181-186.(57) Штамм бактерийБИМ В-452 - продуцент пуриннуклеозидфосфорилазы. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генной инженерии, и решает задачу получения нового высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ). ПНФ (КФ 2.4.2.1) катализирует фосфоролитическое расщепление молекулы пуриновых нуклеозидов (например, инозина) на пентозо-1-фосфат и пуриновое основание согласно реакции 13127 1 2010.04.30 Обратимый характер реакции позволяет ее использовать для синтеза фармакологически важных модифицированных нуклеозидов 1-5. Известны штаммы бактерий, продуцирующие ПНФБМТ-38, используемый для получения 3-амино-2,3-дидезоксигуанозина 6,БМТ-3 Д/1 А,используемый для получения рибавирина 7,БМТ-2 Д/1 А, предназначенный для получения 2-дезоксиаденозина 8,БМ-21, используемый в способе получения 2-хлор-2-дезоксиаденозина 9,ТН 6-2,-21,-23, предложенные для получения аденозина, 2-дезоксиаденозина и 2,3-дидезоксиаденозина 10. Общим недостатком перечисленных штаммов является низкая продуктивность в отношении ПНФ, так как они получены стандартными методами микробиологической селекции и их клетки содержат одну копию гена, кодирующего ПНФ. Известен рекомбинантный штамм бактерий 21(3)/1 продуцент ПНФ 11. Удельная активность ПНФ после разрушения клеток этого штамма ультразвуком составляет 72 ед./мг белка. За единицу активности принято количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль инозина за 1 мин при 25 С. Данные по продуктивности штамма в отношении ПНФ (в ед. активности/мл культуральной жидкости) в работе не приведены, и рассчитать их не представляется возможным. Известен штамм бактерий 21(3)/1, использующийся в способе получения рекомбинантной ПНФ 12. ПНФ накапливается в клетках этого штамма в количестве 60-70 от суммарного белка клеток. Данные по продуктивности штамма в отношении ПНФ (в ед. активности/мл культуральной жидкости) в работе также отсутствуют. Известен рекомбинантный штамм бактерий 1655/707, продуцирующий ПНФ в количестве 2400 ед./г сырых клеток 13. За единицу активности принято количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль инозина за 1 мин при 30 С. Данные по продуктивности штамма 1655/707 в отношении ПНФ отсутствуют. Из известных штаммов-продуцентов ПНФ наиболее близким по активности к предлагаемому является штамм 533/380 (прототип) 14. Удельная активность фермента в лизате клеток составляет 18 ед./мг белка. За единицу активности принято количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль инозина за 1 мин при 25 С. Штамм-прототип получен трансформацией 533 рекомбинантной плазмидой 380, в которую встроен ген , ответственный за синтез ПНФ. Ген , кодирующий ПНФ, изолировали с помощью ПЦР из ДНК фага , несущей фрагмент хромосомыс геном . Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая продуктивность в отношении ПНФ, составляющая 14290 ед./л культуральной жидкости. Настоящее изобретение решает задачу получения штаммаБМ-Д 6 - более продуктивного бактериального штамма-продуцента ПНФ. Источником структурного гена , кодирующего аминокислотную последовательность ПНФ, служила хромосомная ДНК регуляторного мутантаБМТ-4 Д/1 А 15, характеризующегося дерепрессированным синтезом ПНФ. ДНК выделяли с помощью фенол-хлороформного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона 16. Генсинтезировали с помощью ПЦР, используя высокоточную -полимеразу и синтетические олигонуклеотидные праймерыи . Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1 -ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену , выделяли и лигировали в вектор рЕТ 24(, США), рестрицированный по - и-сайтам и обработанный щелочной фосфатазой. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки 5, полученные стандартным кальциевым методом -1989, с последующим высевом на плотную питательную среду(1 триптон, 0,5 дрожжевой экстракт,2 13127 1 2010.04.30 1), содержащую канамицин в концентрации 100 мкг/мл. Каждую из пяти выросших одиночных колоний перенесли в колбы, содержащие 25 мл средыс канамицином, и культивировали 12 ч. Из полученных биомасс стандартным щелочным методом 16 выделили плазмиды, которые проанализировали с использованием рестриктаз,,и . В результате была получена плазмида (названная рЕТБМ-Д 6), несущая генв правильной ориентации. Путем последующей трансформации плазмидой рЕТБМ-Д 6 клеток 21(3) был получен рекомбинантный штаммБМ-Д 6 - суперпродуцент ПНФ. Штамм-продуцентБМ-Д 6 отличается от штамма-реципиента 21(3) наличием нескольких копий рекомбинантной плазмиды рЕТ 24, в которую встроен ген, ответственный за синтез гомологичной ПНФ. В качестве генетического маркера эта плазмида содержит ген , придающий клеткам, трансформированным этой плазмидой,устойчивость к канамицину. КлеткиБМ-Д 6 проявляют способность к суперпродукции ПНФ, которая, судя по электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле, накапливается в клетках в количестве более 70 от суммарного водорастворимого белка. Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-452 Д и характеризуется следующими свойствами. Генотип., , , , , (3) 16. Клетки содержат плазмиду 24 со встроенным геном , кодирующим ПНФ, и геном , детерминирующим устойчивость клеток к канамицину. Морфологические признаки. Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5)(2,0-6,0) мкм подвижные, перитрихальное жгутикование грамотрицательные. На МПА и агаризованной среде Адамса (30 С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые. Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства. Растет на простых питательных средах, содержащих канамицин в количестве 25100 мкг/мл. Диапазон температуры роста бактерий - 8-40 С с оптимумом - 37 С. -оптимум роста находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб. КлеткиБМ-Д 6 могут в качестве единственного источника углерода использовать ацетат, но не цитрат. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют 2 на железо-сахарной среде, не сбраживают лактозу и малонат, не гидролизуют желатин. На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается при встряхивании (-форма). Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 200 мкг/мл). Содержание ГЦ в составе ДНК 56,50,5 мол.(определено оптическим методом). КлеткиБМ-Д 6 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при хранении в холодильнике (4-6 С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный бульон, среда Хоттингера), содержащей канамицин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 -ное обезжиренное молоко) состоянии. КлеткиБМ-Д 6 после разрушения обладают способностью катализировать обратимый фосфоролиз пуриновых нуклеозидов. Активность клеток, измеренная в реакции фосфоролиза инозина, составляет 1800 ед./г или 36000 ед./л культуральной жидкости. 3 13127 1 2010.04.30 Содержание ПНФ в клетках штаммаБМ-Д 6 составляет не менее 70 от суммарного содержания водорастворимого белка, и фермент после разрушения клеток,например, ультразвуком может быть использован без дополнительной очистки или очищен до гомогенного состояния стандартными методами. Для культивированияБМ-Д 6 с целью получения ПНФ применяют питательную среду( 7,0), приготовленную на дистиллированной воде, следующего состава ( ) триптон (, США) 1,0 дрожжевой экстракт (, США) 0,5 1,0 канамицин 100 мкг/мл. Для наработки ПНФ проводят культивирование клетокБМ-Д 6 на -среде, содержащей 100 мкг/мл канамицина, до оптической плотности 0,6 (600 нм), затем индуцируют синтез белка путем внесения изопропилтиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 1 мМ и продолжают культивирование в течение последующих 5 ч. Изменение биомассы бактерий контролируют турбодиметрически (600 нм), используя соответствующую калибровочную кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды с помощью 0,15 Ми разрушают ультразвуком. Активность ПНФ в ультразвуковом лизате клеток определяют по скорости фосфоролиза инозина. Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержит (мМ) инозин - 30, К-фосфатный буфер ( 7,5) - 50 и 0,1 мл ультразвукового лизата клеток с концентрацией белка 0,02 мг/мл. Смесь инкубируют при 25 С при перемешивании на магнитной мешалке. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии в системе хлороформизопропанол-25 -ный аммиак (10101). За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает фосфоролиз инозина в количестве 1 мкмоль за 1 мин в указанных выше условиях реакции. Активность штаммаБМ-Д 6 в сравнении с другими штаммами микроорганизмов представлена в таблице. Сравнение активности предлагаемого и лучших из известных штаммов микроорганизмов Штаммы Выход ферментного белка от суммарного белка клетки,Получено авторами предлагаемого решения 13127 1 2010.04.30 Из данных таблицы следует, что активность штаммаБМ-Д 6 в отношении ПНФ, выраженная в ед./мл культуральной жидкости (продуктивность штамма), значительно выше любого из известных штаммов-продуцентов этого фермента. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения ПНФ. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. КультивированиеБМ-Д 6 в оптимальных условиях. КультивированиеБМ-Д 6 проводят в колбе Эрленмейера объемом 250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об./мин при температуре 37 С. Питательная среда (50 мл) для выращивания приготовляется на дистиллированной воде и имеет следующий состав ( ) триптон - 1,0 дрожжевой экстракт - 0,5- 1,0 ( 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 атм, 15 мин. После стерилизации в среду вносят канамицин до концентрации 100 мкг/мл. В процессе культивирования проводят измерение оптической плотности культуры при 600 нм. При достижении оптической плотности 0,6-1 в среду вносится стерильный ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и культивирование продолжается в течение последующих 5 ч. По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 7000 в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 М раствороми разрушают ультразвуком. Для этого клетки (1 г) суспендируют в 50 мл 10 мМ К-фосфатного буфера( 7,0) и обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов -450 фирмы(США) при мощности 0,2 кВт в течение 3-5 мин. Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15000 . Полученный супернатант используют в качестве источника ПНФ. Активность ПНФ, определенная, как описано выше, составляет 1800 ед./г клеток, или 36 000 ед./л культуральной жидкости. Пример 2. Использование ПНФ, продуцируемой штаммомБМ-Д 6, для синтеза противовирусного нуклеозида - рибавирина. ПНФ в количестве 18,0 ед., полученную, как в примере 1, вносят в реакционную смесь(конечный объем 10,0 мл), содержащую 0,45 г гуанозина, 0,336 г 1,2,4-триазол-3-карбоксамида, 60 мМ К-фосфатный буфер ( 7,0), инкубируют при 60 С в течение 42 ч. В этих условиях выход реакции достигает 88-90 мол.в расчете на исходный 1,2,4-триазол-3 карбоксамид. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси путем ионообменной хроматографии на колонке со смолой 18 в Сформе. Целевой продукт элюируют водой. Элюат выпаривают досуха на роторном испарителе при 50 С. Осадок промывают охлажденным ацетоном и высушивают под вакуумом. Получают 0,497 г хроматографически чистого 1 рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (рибавирина). Таким образом, выход изолированного целевого продукта в расчете на исходный 1,2,4-триазол-3 карбоксамид составляет 68 мол. . Структура целевого продукта подтверждена сравнением его хроматографической подвижности, а также УФ-спектра с соответствующими характеристиками заведомо известного образца. В частности, при хроматографировании на тонкослойных пластинках-254 фирмы(Германия) в системе растворителей изопропанол-хлороформ-25 аммиак (1052) и н-бутанол-25 аммиак (72) подвижность целевого продукта совпадала сзаведомо известного образца рибавирина. Т.пл. целевого продукта 176-178 С лит. данные 18 - 174 С. УФ-спектр ( 7),нм 207 макс (11600). 13127 1 2010.04.30 Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известным штаммомпродуцентом ПНФ значительно более высокой продуктивностью (36000 ед.акт./л культуральной жидкости против 14290 ед.акт./л культуральной жидкости). Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов ПНФ. Источники информации 1.,,,// . - 1981. - . 20. - . 12. . 3615-3621. 2.2230118 2, 2004. 3.,// .. 2006. - . 10. - . 11. - . 197-1215. 4..-// .. - 2007. - . 11. - . 4. - . 317-335. 5.9975 , 08.08.2007. 6. А.с. СССР 1500675 , МПК С 1219/40, 1989. 7. А.с. СССР 1661209 А 1, МПК С 121/20, 1991. 8. А.с. СССР 1705347 А 1, МПК С 12 Р 19/40, 1992. 9.5602 С 1, 2003. 10.5384251, 1995. 11.,,,,,/21(3)//. . - 2002. . 24. - . 1. - . 56-60. 12.2179188 2, 2002. 13.6911341, 2005. 14..,.,.,.,, , ,//. . - 2001. - . 22. - . 180-188. 15.,,,,,-//. . 2002. - . 85. - . 7. . 1901-1908. 16..,.,./ 2- ., 1989. - 2222 . 17. Зинченко А.И., Ерошевская Л.А., Барай В.Н., Михайлопуло И.А. Субстратная специфичность уридин- и пуриннуклеозидфосфорилаз в составе целых клеток// Биополимеры и клетка. - 1988. - Т. 4. -6. - С. 298-302. 18.,,, ,,2,43-// . . . - 1972. - . 15. - . 11. - . 1150-1154. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6