Штамм бактерий Arthrobacter nicotianae БИМ В-391 Д – продуцент глюкозоизомеразы

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Сапунова Леонида Ивановна Лобанок Анатолий Георгиевич Казакевич Ирина Олеговна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ В-391 Д-продуцент глюкозоизомеразы. Изобретение относится к микробиологии, предназначено для использования в биотехнологии получения фермента, применяемого в пищевой промышленности для производства глюкозо-фруктозного сиропа и фруктозы, и касается нового штамма - продуцента глюкозоизомеразы. Коммерческое применение глюкозоизомеразы, являющейся исключительно клеточносвязанным ферментом, обусловливает постоянное усовершенствование технологии ее производства, включая поиск и селекцию не только более активных, но и технологичных штаммов-продуцентов, в т.ч. обладающих высоким уровнем конститутивного синтеза ферментного белка. Известны природные штаммы прокариотических микроорганизмов . , , ,с невысоким уровнем конститутивного синтеза глюкозоизомеразы 1-4. Высокой глюкозоизомеразной активностью характеризуются полученные с использованием химических мутагенов мутантные штаммы 15398 и 15615 5, 6. Однако максимальные активность и стабильность продуцируемых указанными стрептомицетами ферментов проявляются в присутствие катионов кобальта, который является тяжелым металлом и относится к разряду веществ, загрязняющих окружающую среду. Наиболее близким предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является природный штаммВКПМ -1169 - продуцент глюкозоизомеразы 7, обладающий высокими уровнями синтеза глюкозоизомеразы (74 ед/г сухой биомассы) и продуктивности (444 /мин в расчете на 1 л среды). К недостаткам указанного штамма следует отнести следующие штамм продуцирует глюкозоизомеразу на обогащенных органическим азотом средах,включающих дорогостоящие компоненты 11170 1 2008.10.30 штамм продуцирует глюкозоизомеразу исключительно при наличии в среде культивирования специфического индуктора ксилозы штамм для синтеза фермента нуждается в катионах кобальта штамм синтезирует фермент, который эффективно катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу при наличии в реакционной среде кобальта - тяжелого металла,требующего детоксикации использование штамма для получения глюкозоизомеразы, а также ферментного препарата для приготовления глюкозо-фруктозного сиропа предполагает детоксикацию отходов микробиологического производства и дополнительную очистку получаемого пищевого продукта от ионов кобальта. Задачей изобретения является получение нового высокотехнологичного штамма, активно растущего на питательных средах, не содержащих дефицитных и дорогостоящих субстратов, и характеризующегося высоким уровнем конститутивного синтеза глюкозоизомеразы, которая катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу без участия ионов кобальта. Удовлетворяющий указанным критериям штамм получен путем направленного отбора адаптированных к высоким концентрациям мочевины вариантовБИМ В-5 и депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-391 Д. Штамм при внутрижелудочном, внутрибрюшинном и интраназальном введении не оказывает патогенного, токсигенного и токсического действия на лабораторных белых мышей, крыс и морских свинок. Штамм без потери культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств, в том числе и глюкозоизомеразной активности, длительно хранится в лиофильно высушенном состоянии, а также при 4 С на агаризованных средах с мочевиной под слоем вазелинового масла и методом периодических пересевов дважды в год. Культурально-морфологические свойства. Относится к группе актино-бактерий. На агаризованной среде с глюкозой и мочевиной образует колонии правильной круглой формы диаметром 2-3 мм с конусовидным профилем, непрозрачные. Окраска колоний сначала светло-бежевая, с возрастом приобретающая зеленоватый оттенок. Поверхность колоний гладкая, блестящая, край ровный, структура гомогенная, консистенция маслообразная. Клетки бактерий сначала круглые, собранные в цепочки, а затем удлиняющиеся и распадающиеся на группы, по 1-3 в каждой. Окраска по Граму положительная. Эндоспоры отсутствуют. Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Оптимальные условия для роста - рН 6,0-8,0 и температура 27-29 С. Хемоорганотроф. Ассимилирует глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу, дульцит, инозит, ксилит, сорбит, маннит, глицерин,этанол, пектин, органические кислоты - лимонную, уксусную, пировиноградную, янтарную, фумаровую. Гидролизует ксилан, крахмал и пектин. На среде с ксилозой образует полисахарид. Усваивает аммонийную и белковую формы азота желатину и казеин разжижает, молоко пептонизирует. Нитраты не утилизирует. Клетки штаммаБИМ В-391 Д при глубинном выращивании на питательных средах, содержащих, как минимум, по одному из указанных выше субстратов в качестве источников углерода и азота, характеризуются способностью эффективно трансформировать -глюкозу в -фруктозу. Реакционная смесь для определения глюкозоизомеразной активности штамма включает 0,2 мл 1 М раствора глюкозы, 0,5 мл 0,2 М ,-фосфатного буфера, рН 7,8 0,1 мл 0,1 М 472 0,2 мл суспензии клеток бактерий и дистиллированную воду до объема 2 мл. 11170 1 2008.10.30 За единицу глюкозоизомеразной активности принимают такое количество фермента,которое при 70 С и рН 7,8 за 1 мин трансформирует 1 мкмоль -глюкозы в -фруктозу. Ферментативную активность штамма выражают в единицах ферментативной активности в расчете на 1 г сухой биомассы (ед/г), продуктивность - в мкмоль фруктозы, образовавшейся в реакции изомеризации за 1 мин, в расчете на 1 л культуральной жидкости(М/минл). Определение -фруктозы проводят цистеин-карбазольным методом 8. Суть изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Питательная среда для культивирования актинобактерийБИМ В-391 Д - продуцента глюкозоизомеразы содержит (в ) К 2 НРО 4 - 0,3 и 472 - 0,1,качественный и количественный состав источников углеродного и азотного питания приведен в табл. 1. Таблица 1 Характеристика глюкозоизомеразной активности заявляемого штамма,растущего на средах различного состава, и штамма-прототипа Источники питания Ксилоза Глюкоза Пептон Кукурузный экстракт Мочевина СоС 126 Н 2 О Глюкозоизомераза Концентрация Наличие источника питания в среде культивирования источникапитания,БИМ В-391 Д ВКПМ -1169 (прототип) 0,5 ед/г 125 116 130 135 128 129 74 698 695 712 718 720 715 444 М/минл Примечание - источник питания присутствует (-) - источник питания отсутствует В качестве посевного материала применяют водную суспензию бактерий (0,51071107 клеток/мл среды), выращенных на глюкозо-мочевинном агаре при 28-29 С в течение 3 сут. Глубинное выращивание штамма проводят в 250 мл колбах Эрленмейе, содержащих 50 мл стерильной питательной среды различного состава, на биологической качалке (180200 об/мин) в течение 60-72 ч при 27-29 С. По окончании культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием (6000, 20 мин), промывают дистиллированной водой и используют для определения глюкозоизомеразной активности. По сравнению со штаммом-прототипом предлагаемый штаммБИМ В-391 Д характеризуется существенно более высокими показателями уровня синтеза фермента (в 1,57-1,82 раза) и продуктивности (в 1,57-1,62). Причем, указанный результат достигается при использовании для выращивания штамма-продуцента питательных сред,не содержащих специфический субстрат - ксилозу, а также дорогостоящих, ростактивирующих и требующих детоксикации соединений. Пример 2. Питательная среда для культивирования актинобактерий АБИМ В-391 Д содержит (в ) мочевину - 0,25 К 2 НРО 4 - 0,3 472 - 0,1 и один из приведенных в табл. 2 источников углеродного питания. Условия культивирования описаны в примере 1. 3 11170 1 2008.10.30 Таблица 2 Глюкозоизомеразная активность заявляемого штамма в зависимости от утилизируемого источника углерода Глюкозоизомеразная активность ед/г М/минл Ксилоза 1201,7 61210 Глюкоза 1321,9 71212 Фруктоза 1252,0 4508 Дульцит 782,1 42513 Инозит 752,3 45711 Ксилит 842,5 49615 Манит 832,1 45313 Сорбит 821,9 4468 Лактоза 801,8 48010 Сахароза 902,4 54915 Крахмал 943,0 4897 Ксилан 872,1 58315 Пектины свекловичный 881,3 63412 цитрусовый 901,7 64813 яблочный 952,0 70316 Кислота лимонная 991,5 4369 Примечание- источник углерода вносили 1 по весу Заявляемому штамму присущ конститутивный характер синтеза фермента, что обеспечивает его несомненное технологическое преимущество (возможность неограниченного выбора источников углеродного питания) перед штаммом-прототипом, продуцирующим глюкозоизомеразу исключительно при наличии в среде культивирования ксилозы. Пример 3. Масштабирование процесса культивирования штамма-продуцента осуществляют в ферментере объемом 100 л. Условия культивирования и состав питательной среды, как в примере 2, за исключением того, что в качестве дешевого источника углерода используют отход производства кристаллической глюкозы из крахмала - зеленую патоку в количестве 1,5-2 в пересчете на содержание в ней глюкозы. Глюкозоизомеразная активностьБИМ В-391 Д составляет 135 ед/л,продуктивность - 750 М/минл. Пример 4. При установлении влияния катионов кобальта на активность глюкозоизомеразы, продуцируемой предлагаемым штаммом, выращенную в ферментере (пример 3) биомассу бактерий отделяют от культуральной жидкости, промывают дистиллированной водой,подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют (10000 , 30 мин). Фермент,содержащийся в бесклеточном экстракте (супернатанте), подвергают исследованию. Реакционная смесь для определения активности содержит 0,2 мл 1 М раствора глюкозы, 0,5 мл 0,2 М К,-фосфатного буфера, рН 7,8 0,1 мл 0,1 М 472 0,2 мл ферментного раствора, 0-0,1 СоС 126 Н 2 О и дистиллированную воду до объема 2 мл. В отличие от глюкозоизомеразы штамма-прототипа, фермент актинобактерийБИМ В-391 Д не требует присутствия в реакционной среде катионов кобальта для эффективной изомеризации глюкозы во фруктозу (табл. 3). Указанное свойство фермента является одним из неоспоримых преимуществ заявляемого штамма, которое исключает необходимость очистки глюкозо-фруктозного сиропа, производимого ферментативным путем, от тяжелого металла - кобальта. Источник углерода, 1 по углероду 11170 1 2008.10.30 Таблица 3 Влияние катионов кобальта на активность глюкозоизомеразыБИМ В-391 Д ВКПМ -1169 (прототип) СоС 126 Н 2,к максимумук максимуму/минл М/минл 0 712 100 нет данных 0,010 712 100 нет данных 0,025 710 99,7 444 100 0,050 695 97,6 нет данных 0,100 650 91,3 нет данных В табл. 4 суммированы данные, касающиеся экономики технологических стадий поддержания предлагаемого штамма и штамма-прототипа, получения посевного материала и культивирования. Как видно, заявляемый штамм в 1,6-1,82 раза превосходит штамм-прототип по глюкозоизомеразной активности (127-135 ед/г) и продуктивности (710-750 /минл). При этом указанный эффект достигается за существенно более короткий промежуток времени (126-156 ч против 206-216 ч) и при использовании в технологическом процессе более простых и дешевых питательных сред. Таблица 4 Сравнительная характеристика экономичности технологических стадий поддержания штаммов-продуцентов глюкозоизомеразы,получения посевного материала и культивирования Наличие параметра сравнения в среде культивирования Питательные Параметры сравнения Для приготовле- мочевина ния посевного пептон Для культивиро вания штамма- кукурузный экстракт продуцента 11170 1 2008.10.30 Таким образом, заявляемый штаммБИМ В-391 Д по важнейшим показателям - глюкозоизомеразной активности, продуктивности, технологичности - превосходит известные аналоги и может использоваться для разработки экономичной ресурсосберегающей технологии получения ферментного препарата глюкозоизомеразы, предназначенного для производства глюкозо-фруктозного сиропа - натурального заменителя сахара диетического и лечебно-профилактического питания. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6