Способ определения концентрации ДНК Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae в биологическом материале

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНКИВ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Костюк Светлана Андреевна Силич Татьяна Владимировна Полуян Ольга Сергеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения концентрации ДНКив биологическом материале, заключающийся в том, что выделяют ДНКииз биологического материала и проводят с ними мультиплексную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с праймерами 53, 53, 5-3 и 5- -3 иолигонуклеотидными мечеными пробами 53 и 53, причем на этапе амплификации ДНКипроводят денатурацию ДНК при температуре 95 С в течение 5 минут, отжиг сначала при температуре 50 С в течение 2 минут, а затем при температуре 95 С в течение 10 минут и элонгацию сначала при температуре 95 С в течение 15 секунд в количестве 50 циклов, а затем при температуре 60 С в течение 1 минуты, и концентрацию ДНК 1, выраженную в количестве копий на 1 мл биологического материала, рассчитывают по формуле днк 1 10 ( 0,338 11,378 ) ,пцр экстр где днк - объем ДНКи, выделенных из биологического материала, мкл пцр - объем ДНК, взятый для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, мкл экстр - объем биологического материала, мкл 1 10908 1 2008.08.30- значение цикла амплификации, при котором флуоресценция превышает пороговый уровень,а концентрацию ДНК 2, выраженную в количестве копий на 1 мл биологического материала, рассчитывают по формуле 10 ( 0,340 12,678) , где днк - объем ДНКи, выделенных из биологического материала, мкл пцр - объем ДНК, взятый для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, мкл экстр - объем биологического материала, мкл- значение цикла амплификации, при котором флуоресценция превышает пороговый уровень. Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ определения концентрации ДНКпутем моноплексной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиемолигонуклеотидных меченых проб, при котором определяется концентрацияв ПЦР смеси. Данный способ является прототипом по отношению к заявляемому способу 1. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение концентрации ДНКв режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиемолигонуклеотидных меченых проб. Однако указанный способ обладает следующими недостатками определяют концентрацию ДНК только одного возбудителя хламидиально-микоплазменной природы, а именно, при заданном режиме амплификации с использованием праймеров иолигонуклеотидных меченых проб,выбранных для проведения моноплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, что увеличивает время и количество проводимых исследований в связи с необходимостью проведения дополнительной реакции с другим режимом амплификации для определения концентрации ДНКи концентрацию ДНКопределяют в ПЦР смеси, что усложняет интерпретацию результата определения концентрации ДНКметодом реал-тайм ПЦР с использованиемолигонуклеотидных меченых проб. Задачей заявляемого способа является сокращение времени и количества проводимых реакций при расширении спектра определяемых концентраций возбудителей хламидиально-микоплазменной природы с получением легко интерпретируемого результата определения концентрации ДНКив биологическом материале. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения концентрации ДНКив биологическом материале, заключающийся в том, что выделяют ДНКииз биологического материала и проводят с ним мультиплексную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с праймерами 53, 53, 53, и 53 иолигонуклеотидными мечеными пробами 53, и 52 3, причем на этапе амплификации ДНКипроводят денатурацию ДНК при температуре 95 С в течение 5 минут, отжиг сначала при температуре 50 С в течение 2 минут, а затем при температуре 95 С в течение 10 минут и элонгацию сначала при температуре 95 С в течение 15 секунд в количестве 50 циклов, а затем при температуре 60 С в течение 1 минуты, и концентрацию ДНК 1, выраженную в количестве копий на 1 мл в биологического материала, рассчитывают по формуле 1 10 ( 0,338 11,378) ,1 днкпцр экстр где днк - объем ДНКи, выделенных из биологического материала, мкл пцр - объем ДНК, взятый для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, мкл экстр - объем биологического материала, мкл, - значение цикла амплификации при флуоресценции превышает пороговый уровень а концентрацию ДНК 2, выраженную в количестве копий на 1 мл в биологического материала, рассчитывают по формуле 1 10( 0,340 12, 678) , 2 днкпцр экстр где днк - объем ДНКи, выделенных из биологического материала, мкл пцр - объем ДНК, взятый для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, мкл экстр - объем биологического материала, мкл, - значение цикла амплификации при флуоресценции превышает пороговый уровень. Пример. Необходимо определить концентрацию ДНКи концентрацию ДНКв 1 мл мокроты пациента А с клиническим диагнозом пневмония. На первом этапе из 100 мкл (экстр) мокроты суммарную ДНК выделяют сорбционным методом адсорбции на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия, отмывая этиловым спиртом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа ), добавляют 300 мкл раствора(лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента (2). Пробы инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая на микроцентрифуге Вортекс -1500 (Хеликон, Россия) при 1500 об/мин. Пробы центрифугируют в течение 15 сек на центрифуге Циклотепм 201 (СТМ, Россия) при 12 тыс. оборотов в минуту, супернатант удаляют. К осадку добавляют 100 мкл раствора(промывочного, 96 этанол, содержащий 100 мМ ацетат натрия (рН 4,8, встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием раствора(промывочного, 70 этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат (модель 205, СТМ, Россия) и подсушивают пробы 5 минут при температуре 50 С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мкл ТЕ буфера (на 1 л буфера 0,04 М Трис-ацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0) и инкубируют в течение 5 минут при 50 С. Пробирки центрифугируют в течение 15 сек при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. 3 10908 1 2008.08.30 На втором этапе осуществляют амплификацию суммарной ДНК общим объемом 50 мкл (днк), выделенную из биологического материала (мокроты), и ДНК стандартов, которые необходимы для определения концентрации ДНК при проведении ПЦР в режиме реального времени. Используемыми стандартами для определения концентрацииислужат 10-кратно разведенные серии очищенного геномаиизвестных концентраций в диапазоне от 102 до 104 копий/мл. Проводят подготовку пробирок с ПЦР-смесью-1, содержащей смесь специфических праймеров, позволяющих детектировать специфические фрагменты ДНКи, и нуклеотиды, раскапанные под воск. Размораживают пробирку с ПЦР-смесью-3, содержащую смесьолигонуклеотидных меченых проб, которые комплементарны специфическим фрагментам ДНКи, и тщательно перемешивают содержимое. Праймеры для детекциии последовательности олигонуклеотидных меченых проб были выбраны из -1 фрагмента, кодирующего протеин клеточной адгезии (номер в 001593) с использованиемпрограммного обеспечения. 1 - 53 - (-праймер), 2 - 5-3 - (-праймер) определяют границы -1 фрагмента длиной 82 п.н., кодирующего протеин клеточной адгезии (номер вАЕ 001593).олигонуклеотидная меченая проба 53 метитсяв качестве флуорофора по 5 концу ипо 3 концу в качестве гасителя. Праймеры для детекциии последовательности олигонуклеотидных меченых проб были выбраны из Р-1 фрагмента, кодирующего протеин клеточной адгезии (номер в 07191) с использованиемпрограммного обеспечения. 2 - 53 - (-праймер), ограничивают участок в 76 пар оснований Р 1 фрагмента, кодирующий Р 1 протеин клеточной адгезии (номер в 07191).олигонуклеотидная меченая проба 53 метится АМ в качестве флуорофора по 5 концу ипо 3 концу в качестве гасителя. Праймеры и олигонуклеотидные меченые пробы для,смешивают. Во избежание конкуренции используют ограниченные концентрации праймеров, в этом случае чрезмерное количество реагентов доступно для амплификации ДНК другого, потенциально присутствующего в небольшом количестве патогена. Готовят верхнюю ПЦР-смесь из расчета 7 мкл ПЦР-смеси-2 (буфер и полимераза) на одну реакцию. В пробирки с ПЦР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл верхней ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1. В подготовленные таким образом пробирки вносят ДНК (пцр) по следующей схеме пробирка 1-5 мкл ДНК, выделенной из клинического образца,пробирка 2-5 мкл смеси Стандарт 1(конц. 102 копий/мл) и Стандарт 1(конц. 102 копий/мл),пробирка 3-5 мкл смеси Стандарт 1(конц. 102 копий/мл) и Стандарт 1(конц. 102 копий/мл), 4 10908 1 2008.08.30 пробирка 4-5 мкл смеси Стандарт 2(конц. 103 копий/мл) и Стандарт 2(конц. 103 копий/мл),пробирка 5-5 мкл смеси Стандарт 2(конц. 103 копий/мл) и Стандарт 2(конц. 103 копий/мл),пробирка 6-5 мкл смеси Стандарт 3(конц. 104 копий/мл) и Стандарт 3(конц. 104 копий/мл),пробирка 7-5 мкл смеси Стандарт 3(конц. 104 копий/мл) и Стандарт 3(конц. 104 копий/мл),пробирка 8-5 мкл отрицательного контрольного образца. Помещают пробирки в ячейки ротора термоциклера 3000 ( , Австралия). Задают следующую программу для одновременной амплификации ДНКи ДНК 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали)95 С 5 мин. 2. Отжиг (присоединение праймеров)50 С 2 мин.95 С 10 мин. 3. Элонгация (достраивание цепей ДНК)95 С 15 сек. - 50 циклов 60 С 1 мин. Этап амплификации при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиемолигонуклеотидных меченых проб основан на использовании 5-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5-конце флуоресцентным красителем, а на 3-конце - фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Пробы комплементарны участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров олигонуклеотидная меченая проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может детектироваться. Увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходной концентрацией матрицы, что дает возможность точно оценить концентрацию ДНК в биологическом материале. Цикл , при котором флуоресценция превышает пороговый уровень, задаваемый автоматически, используют для расчета концентрации ДНКи. Итоговые уравнения, характеризующие взаимосвязь порогового цикла флуоресценции и количества амплифицированной ДНК, а именно 1 10 ( 0,338 11,378) ,1 днкпцр экстр и взаимосвязь порогового цикла флуоресценциии количества амплифицированной ДНК, а именно 12 днк 10 ( 0,34012,678) ,пцр экстр используются для расчета концентраций ДНКив 1 мл мокроты. При определении концентрации ДНКпутем мультиплексной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием смесиолигонуклеотидных меченых проб и смеси праймеров для проведения одновременной амплификации ДНКиу данного пациента значение порогового цикла 25,75, поэтому 10( 0,33825, 7511,378)47,26 (копий / мл мокроты). 5 100 При определении концентрации ДНКпутем мультиплексной количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием смесиолигонуклеотидных меченых проб и смеси праймеров для проведения одновременной амплификации ДНКиу данного пациента значение порогового цикла 32,48, поэтому 50 1 2 10 ( 0,34032, 4812,678)43,13 (копий / мл мокроты). 5 100 У данного пациента обнаружены этиологически значимые концентрации обоих возбудителей (и) в мокроте, что позволяет судить о смешенной инфекции и необходимости назначения соответствующего протокола лечения. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующее преимущество мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованием смесиолигонуклеотидных меченых проб и смеси праймеров для проведения одновременной амплификации ДНКиопределяют концентрацию ДНК,в высокостандартизированном формате в течение 4-5 ч, что чрезвычайно экономично для образцов малого количества, без обработки ПЦР продуктов, что снижает риск ложноположительных результатов, которые могут иметь место при манипуляциях с ампликонами. 1 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6