Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций Chlamydia trachomatis, Micoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале

(51)01 33/50 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ,ИВ ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Костюк Светлана Андреевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения у больного возбудителей урогенитальных инфекций, выбранных из группы,и, включающий выделение ДНК возбудителя из биологической пробы, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретическое разделение продуктов амплификации, отличающийся тем, что при выделении фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных единиц размером 465-475 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии в биологической пробе, при выделении фрагментов ДНК с молекулярной массой от 75000 до 80000 относительных единиц размером 950-960 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 110130 относительных единиц - о наличии, а при выделении фрагментов ДНК с молекулярной массой от 52000 до 57000 относительных единиц размером 650-660 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 60-80 относительных единиц - о наличии. Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ определения,ив соскобе эпителиальных клеток из уретры и цервикального канала путем осуществления полимеразной цепной реакции, при котором после проведения электрофоретического разделения продуктов амплификации определяют наличие в исследуемом образце синтезированного фрагмента молекулы ДНК по расстоянию пробега в исследуемой 7967 1 2006.04.30 пробе, и если это расстояние соответствует расстоянию пробега в пробе положительного контроля, то это свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК возбудителя и при наличии фрагментов молекул ДНК,исудят о наличии этих микроорганизмов. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому способу 1. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение,ив исследуемом матерале из уретры и цервикального канала путем осуществления полимеразной цепной реакции с электрофоретическим разделением продуктов амплификации. Однако указанный способ обладает следующим недостатком из-за того, что этап электрофореза не дает возможности получить конечный продукт анализа и не позволяет четко интерпретировать полученные данные, возникает двойственность в оценке результатов, что искажается точность определения. Задачей заявляемого способа является повышение точности определения. Поставленная задача достигается следующим способом. Предложен способ определения возбудителей урогенитальных инфекций, выбранных из группы,и, включающий выделение ДНК возбудителя из биологической пробы, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретическое разделение продуктов амплификации, при этом при выделении фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных единиц размером 465-475 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии в биологической пробе, при выделении фрагментов ДНК с молекулярной массой от 75000 до 80000 относительных единиц размером 950-960 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 110-130 относительных единиц - о наличии, а выделение фрагментов ДНК с молекулярной массой от 52000 до 57000 относительных единиц размером 650-660 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 60-80 относительных единиц - о наличии. Поскольку структура ДНК каждого микроорганизма индивидуальна, то получение молекулярных характеристик фрагментов ДНК возбудителей в процессе синтеза и сравнение с данными контрольных образцов, дает возможность исключить двойственность в интерпретации полученных характеристик возбудителя в исследуемом материале. Пример 1. Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента А. с клиническим диагнозом - эндоцервицит, эрозия шейки матки. Выделение ДНК из всех биологических проб проводят сорбентным методом (адсорбция ДНК на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатиоционата натрия). Условия синтеза ДНК соответствуют рекомендациям производителя тест-системы. Полученные ампликоны разгоняют электрическим током при электрофорезе с фиксированным напряжением 150 В Эльф-2 (ДНК-технология) в 1,5 агарозном геле, содержащем 1 бромистый этидий в течение 30 мин при напряжении 10 В/см. Анализ результатов проводят с использованием трансиллюминатора Н-2 (Петротерм, Россия) с применением видеосистемы для регистрации гелей - (Петротерм, Россия) с помощью программыверсия 1,0 на базе компьютера-4. Идентификацию ПЦР-результатов проводят по следующим критериям выявление в биологических пробах специфического ПЦР-продукта соответствие размера ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукту контрольной пробы соответствие молекулярной массы ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукту контрольной пробы соответствие интенсивности свечения ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукту контрольной пробы. 2 7967 1 2006.04.30 При анализе биологические пробы считаются положительными, если молекулярные характеристики ДНК-продукта в клиническом образце соответствует молекулярным характеристикам ДНК-продукта контрольной пробы. Результаты анализа биологического материала от пациентов считаются отрицательными, если в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаружено или он выявлен, но его молекулярные характеристики ДНК не соответствуют молекулярным характеристикам фрагмента молекулы контрольной ДНК возбудителя. Фрагмент контрольной ДНКимеет размер 470 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 79 относительных единиц и молекулярной массой 38786,0 относительных единиц фрагмент контрольной ДНК- 956 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 120 относительных единиц и молекулярной массой 77715,0 относительных единиц фрагмент контрольной ДНК для 654 пар нуклеотидов с интенсивностью свечения 80 относительных единиц и молекулярной массой 55384,0 относительных единиц. В табл. 1 представлены молекулярные характеристики контрольных ДНК,и, где указаны их молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения. В табл. 2 представлены молекулярные характеристики фрагмента молекулы ДНК по заявляемому способу в пробе 1 от пациента А. с клиническим диагнозом - эндоцервицит, эрозия шейки матки - молекулярная масса составила 39012 относительных единиц,размер 470 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 82 относительных единиц, из которых видно, что у пациента А. в исследуемом материале выявлена ДНК. Пример 2. Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента В. с клиническим диагнозом хронический неспецифический уретрит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики фрагмента ДНК в исследуемом материале у пациента В. с клиническим диагнозом хронический неспецифический уретрит - проба 2. В табл. 2 представлены молекулярные характеристики фрагмента молекулы ДНК по заявляемому способу в пробе 2 от пациента В. с клиническим диагнозом - хронический неспецифический уретрит - молекулярная масса составила 78430 относительных единиц о.е., размер 956 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 126 относительных единиц, из которых видно, что у пациента В. в исследуемом материале выявлена ДНК. Пример 3. Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики фрагмента ДНК в исследуемом материале у пациента С. с клиническим диагнозом эндоцервицит - проба 3. В табл. 2 представлены молекулярные характеристики фрагмента молекулы ДНК по заявляемому способу в пробе 3 от пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит - молекулярная масса составила 56216 относительных единиц, размер 654 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 68 относительных единиц, из которых видно, что у пациента С. в исследуемом материале выявлена ДНК. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующие преимущества 7967 1 2006.04.30 Таблица 1 Молекулярные характеристики контрольных ДНК,и- молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения Полосы фрагментов ДНК микроор.-чения Интерпретация методика анализа соблюдена Таблица 2 Молекулярные характеристики фрагментов ДНК в исследуемых пробах 1,2, 3 - молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения Характеристики Проба 1 Проба 2 Проба 3 фрагмента ДНК Количество н.п. 470 956 654 Молекулярная масса 39012,0 о.е. 78430,0 о. е. 56216,0 о.е. Интенсивность 82 о.е. 126 о.е. 68 о.е. свечения Интерпретация присутствие - присутствие присутствиеобеспечивает повышение чувствительности и двойной контроль качества за счет того, что он дает возможность оценивать специфический фрагмент ДНК по размеру, интенсивности свечения и молекулярной массе, что снижает возможность ошибки в интерпретации результатов полимеразной цепной реакции при установлении этиологии заболевания. Источники информации 1.. .. - 1990. - . 28. -6. - . 1254-1260. 2. Лопухов Л.В. и др. Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия. - 2000. - Т. 2. -3. - С. 96-105. 3. Щербо С.Н. и др. Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. -2. - С. 21-24. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4