Способ определения концентрации ДНК возбудителя урогенитального микоплазмоза Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ УРОГЕНИТАЛЬНОГО МИКОПЛАЗМОЗАИ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Бадыгина Наталья Александровна Хулуп Геннадий Яковлевич Костюк Светлана Андреевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения концентрации ДНК возбудителя урогенитального микоплазмозаили, заключающийся в том, что выделяют ДНК возбудителя из соскоба эпителиальных клеток цервикального канала и уретры, проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, причем детекцию амплификационной ДНК осуществляют по флуоресценции с использованием красителя,и определяют концентрацию ДНК, в количестве копий на 1 мл, по формуле Конц.10(-0,278 СТ 11,493),и концентрацию ДНК, в количестве копий на 1 мл, по формуле Конц.10(-0,242 СТ 10,484),где СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая флуоресценции амплификационного продукта пересекаются. Изобретение относится к области медицины, а именно к способам определения концентрации ДНКи, присутствующую в соскобе эпителиальных клеток. Известен способ определения концентрацииив исследуемом клиническом материале на основе культуральной диагностики урогенитальных микоплазмозов. Генитальные микоплазмы могут культивироваться как на жидких, так и на плотных питательных средах. Посев клинического материала на жидкие питательные среды используется как тест на ферменты уреазу (для . ) и аргиназу (для М. ). Под влиянием уреазы и аргиназы происходит расчепление субстратов, приводящих к защилачиванию жидкой питательной среды и изменению цвета индикатора в течение 24-48 ч. Подсчет выросших микроколоний для определения этиологически значимой концентрации микоплазм производят при дальнейшем посеве клинического материала на плотные питательные среды 1. 10771 1 2008.06.30 Недостатком этого способа являются высокие требования к транспортировке проб,данный метод требует сложных питательных сред, и при положительном результате необходимо дальнейшее тестирование образцов для определения концентрациии. Вместе с тем применение ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить быстрое определение концентрации ДНКис высокой чувствительностью и специфичностью. Задачей заявленного способа является в короткие сроки определить концентрацию ДНКи, присутствующую в соскобе эпителиальных клеток с помощью ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителяна этапе детекции продуктов амплификации. Поставленная задача достигается следующим образом Предложенный способ определения концентрации ДНК возбудителя урогенитального микоплазмозаили, заключающийся в том, что выделяют ДНК возбудителя из соскоба эпителиальных клеток цервикального канала и уретры, проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени, причем детекцию амплификационной ДНК осуществляют по флуоресценсии с использованием красителя, и определяют концентрацию ДНК, в количестве копий на 1 мл, по формуле Конц.10(-0,278 СТ 11,493),и концентрацию ДНК, в количестве копий на 1 мл, по формуле Конц.10(-0,242 СТ 10,484),где СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая флуоресценции амплификационного продукта пересекаются. Предложенный способ поясняется графическим материалом. На фиг. 1 представлен качественный анализ наличия ДНКв соскобах эпителиальных клеток по кривым и пикам плавления. На фиг. 2 представлен качественный анализ наличия ДНКв соскобах эпителиальных клеток по кривым и пикам плавления. На фиг. 3 представлена стандартная кривая корреляции между СТ и 10 концентраций копий на 1 мл ДНК-стандартав диапазоне от 3,6104 до 2,25103 копий на 1 мл. На фиг. 4 представлена стандартная кривая корреляции между СТ и 10 концентраций копий ДНК-стандартав диапазоне от 1,5104 до 4,69102 копий на 1 мл. На фиг. 5 представлено СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются (где 1 - пороговая линия, 2 - кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта). Из соскобов эпителиальных клеток ДНК выделяется сорбционным методом адсорбции на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия, отмывая этиловым спиртом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа ), добавляют 300 мкл раствора(лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента(2). Пробы инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая на микроцентрифуге Вортекс -1500 (Хеликон, Россия) при 1500 об/мин. Пробы центрифугируют в течение 15 сек на центрифуге Циклотемп-201 (СТМ, Россия) при 12 тыс. оборотов в минуту, супернатант удаляют. К осадку добавляют 100 мкл раствора(промывочного, 96 этанол, содержащий 100 мМ ацетат натрия (рН 4,8),встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием раствора(промывочного, 70 этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат (модель 205, СТМ, Россия) и подсушивают пробы 5 мин при температуре 50 С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мкл ТЕ буфера 2(на 1 л буфера 0,04 М Трис-ацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0) и инкубировали в течение 5 мин при 50 С. Пробирки центрифугируют в течение 15 сек при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. Для проведения количественного определения ДНКиметодом ПЦР в реальном времени на первом этапе для каждой панели необходимо поставить 6 контрольных образцов-стандартов с известной концентрацией ДНК в дублях и 2 контролей, не содержащих ДНК .реактив состоит из амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой. Отбирают необходимое количество пробирок с ПНР-смесью-1 для амплификации исследуемых и контрольных проб. Готовят 2-кратное титрование ДНК-стандарта с известной концентрацией. Размораживают пробирку с ПЦР-смесью-3 (флуорестентная метка -) и тщательно перемешивают содержимое. Готовят верхнюю ПЦР-смесь из расчета 7 мкл ПЦР-смеси-2 (буфер и -полимераза) и 3 мкл ПЦР-смесью-3 на одну реакцию. В пробирки с ПНР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл верхней ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1. В готовые таким образом пробирки вносят по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических и контрольных проб. Ставят контрольные реакции амплификации для отрицательного контроля. Вместо ДНК-пробы вносили 10 мкл ДНК-буфера, а для положительного контроля вносили 10 мкл ДНК-стандарта. Помещали пробирки в ячейки ротора термоциклера 3000 (, Австралия). Амплификацию ДНК проводили по следующей программе для 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали)95 С 5 мин. 2. Циклирование 95 С 25 с 65 С 25 с - 42 циклов 72 С 25 с 3. Удержание 72 С 2 мин. 4. Плавление в диапазоне 55 С - 99 С, поднимающейся на один градус на каждом шаге время ожидания 30 с на первой ступени время ожидания 10 с на каждой последующей ступени измерение плавления на . Амплификацию ДНКпроводили по следующей программе 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали)95 С 5 мин. 2. Циклирование 95 С 25 с 61 С 25 с - 42 циклов 72 С 25 с 3. Удержание 72 С 2 мин. 4. Плавление в диапазоне 55 С - 99 С, поднимающейся на один градус на каждом шаге время ожидания 30 с на первой ступени время ожидания 10 с на каждой последующей ступени измерение плавления на . Детекция амплифицированной ДНК проводилась с использованием интеркалирующего красителя, основанная на том, что флуоресцентный сигнал отсравнительно низкий в его свободном состоянии, однако сигнал значительно увеличивается, когдавстраивается в двухцепочечную молекулу ДНК. Для детекциифлуорестенции используются / (470/510 ) канал. Флуоресцентный сигнал увеличивается пропорционально с увеличением количества ампликона, произведенного в каждом амплификационном цикле и что может быть использовано для количественного определения ДНК. Учет специфичности результатов ПЦР проводился по анализу кривых плавления, так как -не является специфическим красителем и будет встраиваться в любую двухцепочечную молекулу ДНК. Положительные клинические образцы и положительные контроли будут иметь на графике пики в одном диапазоне температур плавления. 3 10771 1 2008.06.30 Температура плавления ДНКипп 1 2 Отсутствие исследуемой ДНК приведет к отсутствию пиков плавления. Наличие неспецифических продуктов амплификации, праймеров-димеров и т.д. приведет к появлению пиков с другой температурой плавления, отличающейся от температуры плавления специфических ампликонов, как показано на фигурах 1, 2. Для определения концентрации ДНКи - ,присутствующую в исследуемом материале с помощью ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителяна этапе детекции продуктов амплификации построили стандартные кривые серий разведений стандартов ДНК М.ис известной начальной концентрацией геномной ДНК. Для построения стандартной кривой корреляции между СТ и 10 концентраций копий ДНК-стандартабыла проведена амплификация 2-кратного титрования ДНК-стандартав диапазоне от 3,6104 до 2,25103 копий на 1 мл и количественно проанализирована. Каждая серия ДНК-стандартабыла проамплифицирована в дублях вместе с двумя .реактив состоял из сложной ДНК амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой. Корреляции между СТ и 10 концентрации копий ДНК-стандартав мл составила 20,98, как показано на фиг. 3. Значение концентрации ДНКв исследуемом материале высчитывалось по формуле Конц.10(-0,278 СТ 11,493), копий на 1 мл, где СТ - значение цикла при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются, как показано на фиг. 5 (где 1-пороговая линия, 2-кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта). Для построения стандартной кривой корреляции между СТ и 10 концентраций копий ДНК-стандартабыла проведена амплификация 2-кратного титрования ДНКв диапазоне от 1,5104 до 469 копий на 1 мл и количественно проанализирована. Каждая серия ДНК-стандартабыла проамплифицирована в дублях вместе с двумя .реактив состоял из сложной ДНК амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой. Корреляции между СТ и 10 концентрации копий ДНКв мл составила 20,98, как показано на фиг. 4. Значение концентрациив биологическом материале высчитывалось по формуле Конц.10(-0,242 СТ 10,484), копий на 1 мл, где СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются, как показано на фиг. 5 (где 1-пороговая линия, 2-кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта). Пример расчета 1 больная З., 23 года, история родов 1648, беременность 12 нед.,угроза выкидыша. Методом ПЦР с электрофоретической схемой детекции продуктов амплификации в соскобе из цервикального канала и уретры обнаружена, которая является условно-патогенным возбудителем, причем развитие заболевания зависит от массивности инфицирования организма. Такой пороговой концентрацией принято считать 104 КОЕ и более в 1 мл исследуемого материала. При определении концентрации ДНКметодом ПЦР в реальном времени у данной пациентки значение составило СТ 30,32, поэтому Конц. ДНК 10(-0,24230,3210,484)1398,25 копий на 1 мл. 4 10771 1 2008.06.30 У данной пациентки концентрация ДНКв исследуемом материале не превысила пороговую. Пациентка занесена в группу риска по невынашиванию,осталась под наблюдением акушер-гинеколога, специфического антибактериального лечения не получала. Пример расчета 2 больная Ж, 27 лет, история родов 560, преждевременные роды 33-34 нед. Методом ПЦР с электрофоретической схемой детекции продуктов амплификации выявлены такие возбудители инфекций урогенитального тракта каки. При определении концентрации ДНКметодом ПЦР в реальном времени у данной пациентки значение составило СТ 14,59, поэтому Конц. ДНК 10(-0,27814,5911,493)26548306,41 копий на 1 мл. При определении концентрации ДНКметодом ПЦР в реальном времени у данной пациентки значение составило СТ 21,97, поэтому Конц. ДНК 10(-0,24221,9710,484)146736,37 копий на 1 мл. У данной пациентки выявлена этиологически значимая концентрация ДНКив исследуемом материале, превышающая пороговую концентрацию в 10-1000 раз. В результате проведенного исследования пациентке была назначена специфическая антибактериальная терапия. Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить следующие преимущества возможность определения концентрации ДНКив соскобе эпителиальных клеток в течение 1 дня, возможность мониторирования ПЦР активности в реальном времени, закрытая система исключает возможность контаминации, сокращение трудоемкости исследования. Источники информации 1. Хилькевич Н.Д., Скороход Г.А. Методы лабораторной диагностики урогенитальных микоплазмозов Метод. рекомендации. - Мн. МГМИ, 1999. - С. 21. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6