Способ определения устойчивости возбудителя урогенитальной инфекции Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum к природному или полусинтетическому 14- или 15-членному антибиотику группы макролидов

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ УРОГЕНИТАЛЬНОИИНФЕКЦИИС Н Ь А М А В 1 А ТА А С Н 0 М А Т 15. М АСОРЪААМ А НОМ ПАН ИЛИПКЕАРЬААМ А НКЕАНТАСПМ К ПРИРОДНОМУ ИЛИ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКОМУ 1 А - ИЛИ1 5 - ЧЛЕННОМУ АНТИБИОТИКУ ГРУППЫ МАКРОЛИДОВ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования (ВУ)(72) Авторы Костюк Светлана Андреевна Хулуп Геннадий Яковлевич (ВУ)(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования (ВУ)Способ определения устойчивости возбудителя урогенитальной инфекции СШашуШа ггаспошагйз, Мусор 1 а 5 ша Ьошшйз или Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш к природному или полусинтетическому 14- или 15-членному антибиотику группь 1 макролидов, включающий проведение полимеразной цепной реакции со специфическим реагентом, кодирующим Егш-гены устойчивости к антибиотику, и определение наличия Егш-генов, отличающийся тем,что полимеразную цепную реакцию осуществляют с фрагментами генов Егш 1 5 АСТТТСббТАСбСАбАСТбТАб-З и Егш 2 5-ААСС 6 САСААА 6 ТААС-6 АА-СТА-3 и при выявлении у возбудителя фрагментов Егш-генов размером 282 парь 1 нуклеотидов судят о его устойчивости к антибиотику группь 1 макролидов, а при отсутствии таковых судят о чувствительности возбудителя к антибиотику данной группы.Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики.Известен способ определения устойчивости СШашуЩа ггаспошагйз, Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 и Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш к эритромицину путем осуществления полимеразной цепной реакции, при котором определяют устойчивость возбудителей только к природному эритромицину, и при наличии в исследуемом образце синтезированного фрагмента молекуль 1 ДНК Сшашубйа ггаспошайз, Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 и Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш, определяющего устойчивость к природному эритромицину, судят об устойчивости к природному эритромицину. Данный способ является прототипом по отнощению к заявляемому способу 1.Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение устойчивости к эритромицину СШашуШа ггаспошагйз, Мусор 1 а 5 ша Ьошшйз и Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш путем осуществления полимеразной цепной реакции с электрофоретическим разделением продуктов амплификации.Однако указанный способ обладает следующими недостатками определяет устойчивость возбудителей только к одному природному антибиотику - эритромицину и наличие в исследуемом образце синтезированного фрагмента молекулы ДНК, определяющего устойчивость к антибиотику, оценивает путем сопоставления расстояния пробега ДНК в исследуемой пробе с расстоянием пробега в пробе положительного контроля, что снижает точность определения.Задачей заявляемого способа является расширение спектра исследований на устойчивость возбудителей к антибиотикам и повышение точности их определения.Поставленная задача достигается следующим способом.Предложен способ определения устойчивости возбудителя урогенитальной инфекции Сыашубйа ггаспошайз, Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 и Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш к природному и полусинтетическому 14- и 15-членному антибиотику группы макролидов, включающий проведение полимеразной цепной реакции со специфическим реагентом, кодирующим Егшгены устойчивости к антибиотику, и определение наличия Егш-генов, причем полимеразную цепную реакцию осуществляют с фрагментами генов Егш 1 5- АСТТТСССТАСССАСАСТСТАО-З Егш 2 5-ААСС 6 САСАААОТААССАА-СТА-З и при выявлении у возбудителя фрагментов Егш-генов размером 282 пары нуклеотидов судят о его устойчивости к антибиотику группы макролидов, а при отсутствии таковых судят о чувствительности возбудителя к антибиотику данной группы.Поскольку устойчивость возбудителей к природным и полусинтетическим 14- и 15 членнь 1 м антибиотикам группы макролидов определяется ЕгшВ-генами, детерминирующими синтез метилтрансфераз, которые способны изменять участки распознавания антибиотиков, то определение у возбудителей в ДНК фрагментов ЕгшВ-генов дает возможность установить их устойчивость к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов.Необходимо выявить устойчивость к природным и полусинтетическим 14- и 15 членнь 1 м антибиотикам группы макролидов у Сшашубйа ггаспошагйз, выделенной из эпителия цервикального канала у пациента А. с клиническим диагнозом - эндоцервицит, эрозия щейки матки.Для выявления микроорганизмов, устойчивых к макролидам, применяют специфические реагенты, соответствующие участкам ДНК, определяющим устойчивость возбудителей к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов. Они имеют консервативные нуклеотидные последовательности ЕгшВ-генов Егш 1 5 ТОАААОССАТСССТСТСАСАТС-З Егш 2 5-ТТСОССТОТТТСАТТОСТТОАТ-3. Полученные фрагменты ДНК разгоняют электрическим током при электрофорезе с фиксированным напряжением 150 В Эльф-2 (ДНК-технология) в 1,5 агарозном геле, содержащем 1 бромистый этидий в течение 30 минут при напряжении 10 В/см. Анализ результатов проводят с использованием трансиллюминатора Н-2 (Петротерм, Россия), с применением видеосистемы для регистрации гелей 6 е 1-1 ша 3 ег (Петротерм, Россия), с помощью программы 6 е 1 Ехр 1 оег версия 1,0 на базе компьютера 1 ше 1 Реш 111 ш-4. Положительным контролем наличия устойчивости к природным и полусинтетическим 14- и 15 членнь 1 м антибиотикам группы макролидов является плазмида с фрагментом гена ЕгшВ размером 282 пары нуклеотидов.Идентификацию ПЦР-результатов проводят по следующим критериям выявление в биологических пробах специфического ПЦР-продукта соответствие размера ДНКпродукта в клиническом образце размеру ДНК-продукта контрольной пробы.В таблице представлены размеры фрагмента ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНК Сыашубйа шепота 15 в пробе у пациента А. имеют размер фрагмента гена ЕгшВ размером 282 пары нуклеотидов, а следовательно Сыашубйа гаспотагйз устойчива к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов.Размеры фрагментов ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациента А. пациента В. пациента С.Размер фрагмента Проба Проба Проба ДНК пациента А. пациента В. пациента С. Количество н.п. 282 - м Интерпретация Присутствие у Отсутствие у Отсутствие у Сыашубйа Мусор 1 а 5 ша Пгеар 1 а 5 ша ггаспошагтз 11 ош 1 п 15 игеа 1 уйсиш фрагмента гена фрагмента гена фрагмента гена ЕгшВ ЕгшВ ЕгшВ Пример 2 .Необходимо выявить устойчивость К природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов у Мусор 1 а 5 ша Ьошппз, выделенной из плоского уретрального эпителия у пациента В. с клиническим диагнозом хронический уретрит.Аналогичным образом как в примере 1 определяют фрагменты ЕгшВ-генов ДНК возбудителя в исследуемом материале у пациента В. с клиническим диагнозом хронический неспецифический уретрит - проба Не 2.В таблице представлены размеры фрагмента ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНК Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 в пробе Не 2 у пациента В. не имеют размер фрагмента гена ЕгшВ, а следовательно Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 чувствительна к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов.Необходимо выявить устойчивость к природным и полусинтетическим 14- и 15 членнь 1 м антибиотикам группы макролидов у Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 угтсиш, выделенной из эпителия цервикального канала у пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит.Аналогичным образом, как в примере 1, определяют фрагментами ЕгшВ-генов ДНК возбудителя в исследуемом материале у пациента С. с клиническим диагнозом эндоцервицит - проба Не 2.В таблице представлены размеры фрагмента ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш в пробе Не 3 у пациента С. не имеют размер фрагмента гена ЕгшВ, а следовательно Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 чувствительна к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным антибиотикам группы макролидов.Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующее преимущество полимеразной цепной реакцией определяется устойчивость СШашуШа ггаспошагйз, Мусор 1 а 5 ша Поштптз и Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш к природным и полусинтетическим 14- и 15-членным макролидам, что позволяет расширить спектр исследований на устойчивость возбудителей к антибиотикам и повысить точность их определения.1. Соловьева С.В., Цой Е.Г., Зигангирова Н.А., Гамова Н.А., Раковская И.В., Гинцбург А.Л. Выявление тетрациклин- и эритромицинустойчивых щтаммов урогенитальных микоплазм с помощью ПНР // Микробиология, иммунология и вирусология. - 1998. - Не 6. С. 3-6 (прототип).Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.