Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций Chlamydia trachomatis, Micoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ,ИВ ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Костюк Светлана Андреевна Хулуп Геннадий Яковлевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций,ив исследуемом материале пациента путем осуществления полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что к 5 мкл исследуемого материала добавляют амплификационную смесь, содержащую 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл реакционной смеси для синтеза ДНК, по 6 пмоль видоспецифических для,иреагентов и 0,6 мкл фермента -полимеразы, проводят синтез ДНК, электрофоретически разделяют фрагменты ДНК, сравнивают их с соответствующими контрольными ДНК,ии при выявлении в исследуемом материале фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных единиц, размером 465-475 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии, с молекулярной массой от 75000 до 80000 относительных единиц, размером 950-960 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 110-130 относительных единиц -и с молекулярной массой от 52000 до 57000 относительных единиц, размером 650-660 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 60-80 относительных единиц -. Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ последовательного определения,ив исследуемом материале путем осуществления полимеразной цепной реакции, при котором готовят три реакционные пробирки, содержащие исследуемый материал, в каждую из них вносят специфический реагент для синтеза одного из возбудителей, затем по стандартной методике проводят синтез ДНК и после электро 8164 1 2006.06.30 форетического разделения стандартно оценивают размеры фрагментов ДНК возбудителей путем сравнения с контрольными образцами и судят о наличии или отсутствии возбудителей. Данный способ является прототипом по отношению к заявляемому способу 1. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение,ив исследуемом материале путем осуществления полимеразной цепной реакции. Однако указанный способ обладает следующим недостатком при последовательном определении,иполимеразной цепной реакцией анализ необходимо проводить трехкратно, что увеличивает расход диагностических реагентов и удлиняет время проведения исследований. Задачей заявляемого способа является одновременное определение всех видов возбудителей в одной биологической пробе. Поставленная задача достигается следующим способом. Предложен способ определения возбудителей урогенитальных инфекций,ив исследуемом материале пациента путем осуществления полимеразной цепной реакции, когда к 5 мкл исследуемого материала добавляют амплификационную смесь, содержащую 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл реакционной смеси для синтеза ДНК, по 6 пмоль видоспецифических для,иреагентов и 0,6 мкл фермента -полимеразы, проводят синтез ДНК, электрофоретически разделяют фрагменты ДНК, сравнивают их с соответствующими контрольными ДНК,ии при выявлении в исследуемом материале фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных единиц,размером 465-475 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии, с молекулярной массой от 75000 до 80000 относительных единиц, размером 950-960 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 110-130 относительных единиц -и с молекулярной массой от 52000 до 57000 относительных единиц, размером 650-660 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 60-80 относительных единиц -. В табл. 1 представлена схема анализа по заявляемому способу. Поскольку для синтеза ДНК,ииспользуется единая стандартная программа, то внесение в одну реакционную пробирку компонентов для синтеза ДНК всех возбудителей, не изменяя объем смеси, дает возможность одновременно определить наличие ДНК всех видов возбудителей, их ассоциаций в одной биологической пробе. Пример 1 Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента А. с клиническим диагнозом -эндоцервицит, эрозия шейки матки. Для этого в пробирку 1 вносят 5 мкл контрольной ДНК, в пробирку 2 - 5 мкл контрольной ДНК, в пробирку 3 - 5 мкл контрольной ДНК, в пробирку 4 - 5 мкл деионизованной воды, 5 - 5 мкл исследуемого материала. В каждую из пробирок добавляют 20 мкл амплификационной смеси, состоящей из 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл стандартной реакционной смеси для синтеза ДНК, состоящей из 16,6 мМ (4)24, 67( 8,4), 2,5 М 2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, по 2 мМ каждого(, , п 6 пмоль видоспецифических реагентов для синтеза ДНК,и) и 0,6 мкл -полимеразы, после чего пробирки закрывают и центрифугируют в течение 5 секунд при 4000 оборотах в минуту при 18-25 С, затем пробирки переносят в прогретый до 94 С программируемый термостат и проводят синтез ДНК по следующей программе 2 8164 1 2006.06.3093 С 30 сек.93 С 10 сек.60 С 10 сек. - 30 циклов 72 С 10 сек.72 С 60 сек. После этого осуществляют электрофоретическое разделение фрагментов ДНК возбудителей и при получении ДНК по размерам, идентичным размерам ДНК возбудителей контрольных проб, судят о наличии того или иного возбудителя, а при отсутствии фрагмента ДНК данного размера судят об отсутствии возбудителя. В табл. 2 представлены молекулярные характеристики контрольных ДНК,и, где указаны их молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения, при этом фрагмент ДНКимеет молекулярную массу от 35000 до 40000 относительных единиц, размер 465-475 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 70-90 относительных единиц фрагмент ДНКимеет молекулярную массу от 75000 до 80000,размер 950-960 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 110-130 относительных единиц фрагмент ДНКимел молекулярную массу от 52000 до 57000 относительных единиц, размер 650-660 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 60-80 относительных единиц. В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагментов ДНК по заявляемому способу в пробе 5 от пациента А. с клиническим диагнозом - эндоцервицит, эрозия шейки матки видно, что синтезированные фрагменты ДНК в пробирке 4 имели молекулярные характеристики ДНКи- молекулярная масса составила 37430,0 о.е. и 54780,0 относительных единиц, размер 470 и 653 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 80 и 79 относительных единиц, таким образом, у пациента А. в исследуемом материале выявлена ДНКи. Пример 2 Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента В. с клиническим диагнозом - хронический неспецифический уретрит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики фрагментов ДНК в исследуемом материале у пациента В. с клиническим диагнозом хронический неспецифический уретрит. В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагментов ДНК по заявляемому способу в пробе от пациента В. с клиническим диагнозом - хронический неспецифический уретрит видно, что синтезированные фрагменты ДНК имели молекулярные характеристики ДНК- молекулярная масса составила 78430,0 относительных единиц и 53460,0 относительных единиц, размер 956 и 652 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 126 относительных единиц и 72 относительных единиц, таким образом, у пациента В. в исследуемом материале выявлена ДНК. Пример 3 Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта у пациента С. с клиническим диагнозом эндоцервицит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики фрагментов ДНК в исследуемом материале у пациента С. с клиническим диагнозом эндоцервицит. В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагмента молекулы ДНК по заявляемому способу в пробе от пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит видно, что синтезированные фрагменты ДНК имели молекулярные характеристики ДНК 3 8164 1 2006.06.30- молекулярная масса составила 56216,0 относительных единиц,размер 657 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 76 относительных единиц, таким образом, у пациента С. в исследуемом материале выявлена ДНК. По сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующие преимущества позволяет выявить одномоментно весь спектр возбудителей, их ассоциаций у одного пациента сократить расход диагностических реагентов агарозы, бромистого этидия, ТАЕ-буфера,расходного материала сократить время проведения определения возбудителей в биологической пробе у одного пациента. Источники информации 1. Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления хламидийной,микоплазменной и уреаплазменной инфекций в акушерско-гинекологической практике Методические рекомендации. - М., 1996. - прототип. Таблица 1 Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций,ии их ассоциаций в исследуемом материале полимеразной цепной реакции(заявляемый способ) Пробирки 1-3 4, 5, 6 7 Реагенты 1. ДНК возбудителей 5 мкл 2. Вода деионизованная 11,9 мкл 11,9 мкл 16,9 мкл 3. Реакционной смеси 7,5 мкл 7,5 мкл 7,5 мкл 4. -полимеразы 0,6 мкл 0,6 мкл 0,6 мкл 5. Пробирки закрыть и отцентрифугировать в течение 5 секунд при 4000 оборотах в минуту при температуре 18-25 С. 6. Перенести пробирки в прогретый до 94 С программируемый термостат и провести синтез ДНК по специальной программе 93 С 30 сек.93 С 10 сек.60 С 10 сек. - 30 циклов 72 С 10 сек.72 С 60 сек. 7. Провести электрофоретическое разделение ПЦР-амплифицированной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном геле. 8. Наличие фрагментов специфических ДНК возбудителей визиолизировать с помощью ультрафиолетового подсвечивания в транслюминаторе. 9. Определить молекулярную массу, число пар нуклеотидов и интенсивность свечения исследуемых фрагментов молекулы ДНК в исследуемых пробах и сравнить с молекулярными характеристиками контрольных образцов ДНК,и. 8164 1 2006.06.30 Таблица 2 Молекулярные характеристики контрольных ДНК,и- молекулярная масса,размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения Полосы фрагментов ДНК микроор. молекулярная масса число пар нуклеотидов интенсивность свечения Интерпретация 70-90 о.е. Присутствие Методика анали за соблюдена Таблица 3 Молекулярные характеристики фрагментов ДНК в исследуемых пробах пациента А., пациента В., пациента С. - молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения Характеристики фрагмента ДНК Количество н.п. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5