Способ выявления у ксенобиотика сенсибилизирующей способности

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(72) Авторы Шевляков Виталий Васильевич Эрм Галина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(56) Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны. Методические рекомендации. МЗ ЛатвССР,Рига, 1980, с. 3-16.4819 С 1, 2002.2744 1, 1999.6209 1, 2004.(57) Способ выявления у ксенобиотика сенсибилизирующей способности путем проведения провокационной внутрикожной аллергологической пробы на исследуемый ксенобиотик опытным животным, которым ксенобиотик введен предварительно в сенсибилизирующей дозе, и контрольным животным, которым ксенобиотик предварительно не вводили, с последующей оценкой статистической значимости различий в показателях аллергологической пробы - величине диаметра эритемы и приросте толщины кожной складки у опытных и контрольных животных, отличающийся тем, что после инструментального измерения указанных показателей определяют их выраженность в баллах в соответствии с табл. 1 описания, баллы суммируют и при получении статистически значимого различия в сумме баллов у опытных и контрольных животных судят о наличии у ксенобиотика сенсибилизирующей способности. Изобретение относится к медицине, а именно к области экспериментальной аллергологии, токсикологии и фармакологии. Известен способ выявления сенсибилизации у человека путем постановки внутрикожных аллергологических проб (далее - ВАП) 1 (аналог). Способ заключается во внутрикожном введении предполагаемого вещества-аллергена в дозе 0,02-0,1 см 3 на безволосые участки кожи - внутреннюю поверхность предплечья (спины, живота) с параллельным введением на соседние участки кожи растворителя (разводящей жидкости) и 0,1 раствора гистамина в качестве контролей. Интегральную оценку реакции немедленного типа гиперчувствительности проводят через 20-30 мин и 6-12 ч по следующей шкале 0 баллов(отрицательная) - реакция, такая как с растворителем 0,5 баллов (сомнительная) - диаметр эритемы менее 10 мм, волдырь диаметром менее 5 мм в ее центре 1 балл (слабоположительная) - диаметр эритемы более 10 мм, волдырь в ее центре 5-9 мм 2 балла (умеренно положительная) - диаметр эритемы более 10 мм, волдырь в центре 10-14 мм 3 балла (резко 10678 1 2008.06.30 положительная) выраженная эритема с волдырем диаметром 15-19 мм 4 балла (очень сильно положительная) - волдырь диаметром более 20 мм с псевдоподиями, разлитой эритемой, периферическими волдырями, общими реакциями. Замедленные реакции оценивают через 24-72 ч по следующей интегральной шкале 0,5 балла- диаметр эритемы,инфильтрата, папулы до 7 мм 1 балл- диаметр 8-19 мм 2 балла- диаметр 20-29 мм 3 балла- диаметр не менее 30 мм. Недостатками данного способа являются возможность использования интегральной бальной оценки ВАП только у человека, поскольку иммунная реактивность у человека выше, чем у животных, и на тонких безволосистых участках кожи пролиферативная отечная воспалительная гипериммунная реакция развивается более выраженно и в основном в виде волдырей учитывается только максимальный линейный размер (диаметр) кожной реакции, который наибольший в направлении внутрикожного введения иглы и вводимого вещества и во многом может зависеть от глубины введения, что не позволяет использовать способ с необходимой чувствительностью и точностью на лабораторных животных. Известен способ выявления сенсибилизации к ксенобиотикам в экспериментах на морских свинках путем постановки ВАП 2 (аналог), который заключается во внутрикожном введении на выстриженные участки кожи спины сенсибилизированных животных разрешающей дозы изучаемого вещества в объеме 0,05 см 3 в концентрации, не вызывающей раздражающего действия у интактных животных (предварительный подбор концентрации). Для контроля растворитель вводится внутрикожно в том же объеме на другой выстриженный участок кожи. Оценку реакции кожи проводят визуально через 24 ч после внутрикожного тестирования в баллах по шкале 0 - видимой реакции нет 1 - бледнорозовая эритема по всему участку кожного окошка и по его периферии 2 - ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии 3 - красная эритема по всему участку 4 инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы 5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек. Недостатками данного способа являются субъективная визуальная оценка выраженности эритематозной реакции, отсутствие количественного учета пролиферативно-отечной реакции кожи, непременно формирующейся при гиперергическом иммунном воспалении, некорректность сравнения результатов опытной и контрольной (с растворителем) пробы только у опытных сенсибилизированных животных вследствие развития у них гиперреактивности и возможности формирования ложной аллергической реакции на внутрикожное введение растворителя, а также неспецифического (раздражающего) действия изучаемого вещества на реализацию специфического иммунного воспаления, что не обеспечивает точность и объективность ВАП. Известен способ оценки внутрикожной аллергологической пробы 3 (прототип), который заключается во внутрикожном введении на выстриженный участок кожи бока животных изучаемого вещества в объеме по 0,1 см 3 в предварительно оттитрованной концентрации, не вызывающей у интактных животных видимой неспецифической воспалительной реакции. Растворитель (контрольная проба) вводится внутрикожно в том же объеме на соседний участок кожи опытным, а также контрольным животным. Реакцию учитывают путем измерения диаметра эритемы, инфильтрата (папулы) или отека с рекомендацией инструментального измерения толщины кожной складки и учета некроза. Оценивают реакцию кожи в баллах с учетом соответствующей реакции у контрольных животных на растворитель и оценкой среднегрупповых показателей реакции в опытной и контрольной группах животных по статистическому критериюСтьюдента. Существенными недостатками данного способа являются отсутствие градационной шкалы (в баллах) оценки степени выраженности кожной эритематозной и пролиферативно-отечной реакции, в целом интегральной оценки аллергической реакции кожи, а также неадекватность сравнения выраженности ВАП у опытных сенсибилизированных животных на изучаемое вещество с таковой только на растворитель у контрольных животных,2 10678 1 2008.06.30 что не обеспечивает объективность и точность оценки ВАП, следовательно, и потенциальной аллергенной способности ксенобиотика. Задачей настоящего изобретения является повышение объективности, точности и чувствительности способа, его упрощение. Предложен способ выявления у ксенобиотика сенсибилизирующей способности путем проведения провокационной внутрикожной аллергологической пробы на исследуемый ксенобиотик опытным животным, которым ксенобиотик введен предварительно в сенсибилизирующей дозе, и контрольным животным, которым ксенобиотик предварительно не вводили, с последующей оценкой статистической значимости различий в показателях аллергологической пробы - величине диаметра эритемы и приросте толщины кожной складки у опытных и контрольных животных, при этом, после инструментального измерения указанных показателей определяют их выраженность в баллах в соответствии с табл. 1 описания, баллы суммируют и при получении статистически значимого различия в сумме баллов у опытных и контрольных животных судят о наличии у ксенобиотика сенсибилизирующей способности. С использованием предлагаемого способа оценены сенсибилизирующие свойства ряда веществ. У сенсибилизированных микробным препаратом, содержащим грибы рода Аспергиллус, животных интегральный показатель ВАП (1,50,27 баллов) достоверно по критерию(0,02) превышал таковой у контрольных животных (0,630,18 баллов, табл. 2). Показатель ВАП у опытных животных (1,380,30 баллов), сенсибилизированных микробным препаратом с содержанием грибов рода Клостридиум, также превышал таковой у контрольных животных (0,500,19) с достоверными (Р 0,05) по критериюразличиями(табл. 3). Следовательно, оба препарата обладают сенсибилизирующей способностью. Если же учет ВАП в данных экспериментах проводился бы только в абсолютных величинах ТКС или только по эритематозной реакции в баллах, как в аналогичном или прототипном способах, то изученные препараты были бы отнесены к веществам, не обладающим аллергенными свойствами. Таблица 1 Шкала бальной оценки эритематозной (ЭР) и пролиферативно-отечной (ТКС) кожных реакций на внутрикожную аллергологическую пробу Абсолютные величины кожных реакций в мм Оценка в баллах 0 0-4,5 0-0,05 1 5,0-10,0 0,1-0,35 2 10,5-15,0 0,4-0,65 3 15,5-20,0 0,7-1,05 4 20,5-25,0 1,1-1,45 5 25,5-30,0 1,5-1,85 6 30,5 и более 1,9 и более Примечание Р - прирост толщины кожной складки (ТКС) по измерению до и после внутрикожного тестирования в мм Интегральный показатель ВАП позволяет не только объективно определить сенсибилизирующую способность ксенобиотика, но и провести его объективное сравнение с другими аллергенами. Например (табл. 4), пыль птицеводческого производства (ППП) и кормовая добавка (КД) - при одинаковых сенсибилизирующих и провокационных дозах высокодостоверно сенсибилизируют опытных животных и, следовательно, являются аллергенами. Однако выраженность сенсибилизирующей способности кормовой добавки 3 10678 1 2008.06.30 существенно выше, поскольку показатель ВАП у опытных животных (5,750,16 баллов) достоверно превышает таковой у животных, сенсибилизированных пылью птицеводческого производства (3,380,42,5,27, 0,001). Более того, интегральный показатель ВАП позволяет использовать жесткий статистический критерий(учитывающий количество животных с соответствующей выраженностью ВАП в опыте и контроле) для оценки аллергенной активности вещества. Так, на препарат гриба Клостридиум показатель ВАП в опыте достоверно отличался от контроля по критерию(0,05), но статистической значимостине установлено (Х 3,0, Р 0,005), тогда как на препарат гриба Аспергиллус различия в опыте и контроле достоверны и по критерию(3,69, Р 0,05). Еще более значимы различия ВАП в опыте и контроле по критериюна ППП и КД (соответственно Х 5,47 и 5,27, Р 0,01). Следовательно, препарат гриба Клостридиум можно отнести к веществам с умеренной, препарат гриба Аспергиллус - с выраженной, а ППП и КД(грибы рода Аспергиллус) внутрикожной аллергологической пробой Группыжив. сравнения Контр. группа Примечание ДСР. - средний диаметр эритемы в мм Р - абсолютная величина прироста толщины кожной складки через 24 ч после внутрикожного тестирования в мм Показатель ВАП - суммарный балл оценки эритематозной и пролиферативно-отечной реакции кожи- математический критерий Ван-дер-Вардена. 4(грибы Клостридиум) внутрикожной аллергологической пробой Группыжив. сравнения Контр. группа Примечание см. табл. 2 Сущность изобретения заключается в следующем. По предлагаемому способу через 1, 6 или 24 ч (в зависимости от выявляемого типа гиперчувствительности) после введения сенсибилизированным (опытным) и контрольным животным внутрикожно в боковые поверхности туловища разрешающей (провокационной) дозы вещества инструментально определяют абсолютные размеры в мм эритематозной и пролиферативно-отечной (толщина кожной складки) реакции кожи и оценивают их согласно градуированной по степени выраженности шкалы в относительных единицах - баллах (табл. 1). По их суммарной величине выводится интегральный показатель ВАП, по которому объективно судят о выраженности специфической гипериммунной реакции и, соответственно, о наличии сенсибилизирующих свойств у изучаемого ксенобиотика. В аналоге же оценивают ВАП визуально только по выраженности эритематозной реакции в сравнении с контрольной пробой, а в прототипе - по величине кожных реакций в баллах без проведения оценки степени их выраженности. Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Опытным (сенсибилизированным известными способами испытуемым веществом) и контрольным (растворитель) лабораторным животным в выстриженный участок боковой поверхности туловища (кожное окошко) внутрикожно вводят микро- или туберкулиновым шприцом в объеме 40-80 5 10678 1 2008.06.30 мкл раствор (вытяжка, экстракт) испытуемого вещества в концентрации, соответствующей или превышающей сенсибилизирующую дозу. До введения и через 1, 6 или 24 ч (в зависимости от выявляемого типа гиперчувствительности) инженерным микрометром или толщиномером измеряют у опытных и контрольных животных толщину кожной складки на кожном окошке с точностью до 0,05 мм, рассчитывают прирост ТКС (Р в мм) и определяют по шкале (табл. 1) выраженность пролиферативно-отечной реакции в баллах. Одновременно измеряют линейкой продольный (в направлении внутрикожного введения) и поперечный (перпендикулярный введению) диаметры эритемы с точностью до 1,0 мм и рассчитывают среднеарифметическую абсолютную величину ее диаметра, определяют выраженность эритематозной реакции по шкале бальной оценки (табл. 1). Таблица 4 Выявление сенсибилизации у морских свинок к экстрактам из пыли птицеводческого производства (ППП) и кормовой добавки (КД) внутрикожной аллергологической пробой ГруппаЭА из ППП срав- п/п ТКС ЭР нен. Балл мм Балл Р, мм Контр. группа ЭА из КД ПокаТКС ЭР Показат. Р, мм Балл зат. мм Балл ВАП,ВАП,балл балл 1 4,5 0 1 0,2 1 6,5 1 2 0 4,0 0 0 0,05 0 5,5 1 1 0 3,5 0 0 0 0 5,0 1 1 0 6,5 1 1 0 0 4,5 0 0 1 4,5 0 1 0,1 1 4,0 0 1 1 7,5 1 2 0,1 1 4,5 0 1 0 4,0 0 0 0 0 4,0 0 0 1 4,5 0 1 0,1 1 5,5 1 2 0,50 4,88 0,25 0,75 0,07 0,50 4,94 0,50 1,00 0,19 0,49 0,16 0,25 0,02 0,19 0,31 0,19 0,27 0,53 1,38 0,46 0,71 0,07 0,53 0,86 0,53 0,76 1 6,5 1 2 1,8 4 10,5 2 6 3 12,0 2 5 1,05 1 11,5 2 3 1,7 2 12,0 2 4 0,9 2 15,5 3 5 0,9 2 8,0 1 3 1,65 2 8,5 1 3 1,3 1 6,0 1 2 1,4 1,75 10,0 1,63 3,38 1,34 0,25 1,16 0,26 0,42 0,13 0,71 3,27 0,74 1,19 0,36 3,99 4,08 4,44 5,37 9,75 0,01 0,01 0,001 0,001 0,001 5,47 0,01 10678 1 2008.06.30 По сумме бальной оценки эритематозной и пролиферативно-отечной кожной реакции у животного определяют интегральный количественный показатель ВАП. О выраженности индукции в организме гиперчувствительности и наличии сенсибилизирующих свойств у испытуемого ксенобиотика судят по статистическому различию среднегрупповых показателей ВАП в опыте и контроле по критериюСтьюдента или . При статистически достоверных различиях при Р 0,05 ксенобиотик является потенциальным аллергеном, при отсутствии - не обладает сенсибилизирующей активностью. При сравнительной оценке сенсибилизирующей способности разных ксенобиотиков аналогично определяют статистические различия среднегрупповых показателей ВАП в опытных группах. Достоверные различия при Р 0,05 по критериюВАП на один из ксенобиотиков по сравнению с другим свидетельствуют о его более выраженной сенсибилизирующей способности. Технический результат заявляемого способа повышение объективности исследования вследствие одновременного учета эритематозной и пролиферативно-отечной гипериммунной реакции кожи и их оценки по бальной шкале в зависимости от дифференцированной выраженности абсолютных величин эритемы и прироста толщины кожной складки, интегральной (обобщенной) оценки внутрикожной аллергологической пробы в баллах повышение точности исследования за счет инструментального измерения и обобщенного учета взаимно перпендикулярных размеров диаметра эритематозной реакции и элиминации влияния направления и глубины внутрикожного введения разрешающей дозы вещества расширение диагностической возможности использования ВАП при интегральной его оценке для сравнения сенсибилизирующей способности разных ксенобиотиков упрощение исследования, так как исключается необходимость постановки контрольной ВАП (с растворителем) у опытных и контрольных животных. Способ промышленно применим в медицине, в частности в экспериментальной аллергологии, токсикологии и фармакологии. Источники информации 1. Новиков Д.К. Клиническая аллергология Справ. пособие. - Мн. Высш. школа,1991. - С. 84-85. 2. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств Фармакологический комитет МЗ СССР от 01.07.88.18. - М., 1988. - С. 10-11. 3. Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны Метод рекомендации МЗ СССР 2121-80 от 23.01.80. Рига, 1980. - С. 12. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7