Способ определения устойчивости возбудителя урогенитальной инфекции Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis или Ureaplasma urealyticum к природному или полусинтетическому антибиотику тетрациклинового ряда

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ,ИЛИК ПРИРОДНОМУ ИЛИ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКОМУ АНТИБИОТИКУ ТЕТРАЦИКЛИНОВОГО РЯДА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Костюк Светлана Андреевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) пособ определения устойчивости возбудителя урогенитальной инфекции,илик природному или полусинтетическому антибиотику тетрациклинового ряда путем осуществления полимеразной цепной реакции со специфическим реагентом, кодирующим -гены устойчивости к антибиотику, и выявления последовательностей - и - генов, отличающийся тем, что полимеразную цепную реакцию осуществляют с последовательностями 1 5--3 и 2 5--3, и при выявлении у возбудителя фрагментов ДНК - и - генов размером 407 пар нуклеотидов судят о наличии у него устойчивости к антибиотику тетрациклинового ряда, а при отсутствии таковых судят о чувствительности возбудителя к данному антибиотику. Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ определения устойчивости,ик тетрациклину путем осуществления полимеразной цепной реакции, при котором определяют устойчивость возбудителей только к природному тетрациклину, и при наличии в исследуемом образце синтезированного фрагмента молекулы ДНК,и, определяющего устойчивость к природному тетрациклину, судят об устойчивости к природному тетрациклину. Данный метод является прототипом по отношению к заявляемому способу 1. 8624 1 2006.10.30 Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение устойчивости к тетрациклинам,ипутем осуществления полимеразной цепной реакции с электрофоретическим разделением продуктов амплификации. Однако указанный способ обладает следующими недостатками определяет устойчивость возбудителей только к одному природному антибиотику тетрациклину и наличие в исследуемом образце синтезированного фрагмента молекулы ДНК, указывающего на устойчивость к антибиотику, оценивают путем сопоставления расстояния пробега ДНК в исследуемой пробе с расстоянием пробега в пробе положительного контроля, но сложности в оценке результатов искажают точность определения. Задачей заявляемого способа является расширение спектра исследований на устойчивость возбудителей к антибиотикам и повышение точности их определения. Поставленная задача достигается следующим способом. Предложен способ определения устойчивости возбудителей урогенитальных инфекций,илик природному или полусинтетическому антибиотику тетрациклинового ряда путем осуществления полимеразной цепной реакции со специфическим реагентом, кодирующим -гены устойчивости к антибиотику, и выявления последовательностей - и -О генов, причем полимеразную цепную реакцию осуществляют с последовательностями 1-5--3 2-5-СТА-3, и при выявлении у возбудителя фрагментов ДНК -М и -О генов размером 407 пар нуклеотидов судят о наличии у него устойчивости к антибиотику тетрациклинового ряда, а при отсутствии таковых судят о чувствительности возбудителя к данному антибиотику. Поскольку устойчивость возбудителей к природным и полусинтетическим антибиотикам тетрациклинового ряда определяется - и -О генов, которые выявляют различные изменения рибосом, способных изменять участки распознавания антибиотиков,вследствие чего сродство антибиотиков группы тетрациклина к местам узнавания на рибосоме падает и они оказывают подавляющее действие на возбудитель, то определение у возбудителей в ДНК фрагментов - и -О генов дает возможность установить их устойчивость к природным и полусинтетическим антибиотикам тетрациклинового ряда. Пример 1. Необходимо выявить наличие феномена устойчивости к антибактериальным препаратам группы тетрациклина у, выделенной из эпителия цервикального канала у пациента А. с клиническим диагнозом - эндоцервицит, эрозия шейки матки. Для выявления микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам тетрациклинового ряда применяют специфические реагенты, соответствующие участкам ДНК, определяющим устойчивость возбудителей к природным и полусинтетическим антибиотикам группы тетрациклина. Они имеют консервативные нуклеотидные последовательности к тетрациклинам - и - 1-5-ТТС-3 2-5 АСАТСС-3. Полученные фрагменты ДНК разгоняют электрическим током при электрофорезе с фиксированным напряжением 150 В Эльф 2 (ДНК-технология) в 1,5 агарозном геле, содержащем 1 бромистый этидий, в течение 30 мин при напряжении 10 В/см. Анализ результатов проводят с использованием трансиллюминатора Н-2 (Петротерм, Россия), с применением видеосистемы для регистрации гелей - (Петротерм, Россия), с помощью программыверсия 1,0 на базе компьютера-4. Положительным контролем наличия устойчивости к антибиотикам группы тетрациклина является плазмида с фрагментом - и-О детерминанты ДНК размером 407 пар нуклеотидов. Идентификацию ПЦР-результатов проводят по следующим критериям выявление в биологических пробах специфического ПЦР-продукта соответствие размера ДНК-продукта в клиническом образце размеру ДНК-продукта контрольной пробы. 2 8624 1 2006.10.30 В таблице представлены размеры фрагмента ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНКв пробе у пациента А. имеют фрагмент - и -О генов ДНК размером 407 пар, а следовательно - устойчивость к природным и полусинтетическим тетрациклинам. Размер фрагментов ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациента А., пациента В., пациента С. Характеристики Проба пациента А. Проба пациента В. Проба пациента С. фрагментов ДНК Количество н.п. 407 407 Присутствие у Присутствие у Отсутствие уИнтерпретация фрагментов - и фрагментов - и фрагментов - и-О генов Пример 2. Необходимо выявить наличие феномена устойчивости к антибактериальным препаратам группы тетрациклина у, выделенной из плоского уретрального эпителия у пациента В. с клиническим диагнозом - хронический уретрит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют фрагменты - и -О генов ДНК возбудителя в исследуемом материале у пациента В. с клиническим диагнозом хронический неспецифический уретрит. В таблице представлены размеры фрагментов ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНКв пробе у пациента В. имеют фрагменты - и -О генов ДНК размером 407 пар, а следовательно - устойчивость к природным и полусинтетическим тетрациклинам проба 2. Пример 3. Необходимо выявить наличие феномена устойчивости к антибактериальным препаратам группы тетрациклина у, выделенной из цервикального эпителия у пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит. Аналогичным образом, как в примере 1, определяют фрагменты - и -О генов ДНК возбудителя в исследуемом материале у пациента С. с клиническим диагнозом - эндоцервицит. В таблице представлены размеры фрагментов ДНК возбудителей в исследуемых пробах пациентов, из которых видно, что синтезированные фрагменты ДНКв пробе 3 фрагментов - и -О генов не имели, а следовательно были чувствительны к природным и полусинтетическим антибиотикам тетрациклинового ряда. Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующее преимущество возможность полимеразной цепной реакцией определить устойчивость,ик природным и полусинтетическим тетрациклинам, что позволяет расширить спектр исследований на устойчивость возбудителей к антибиотикам и повысить точность их определения. Источники информации 1. Соловьева С В., Гой .Г., Зигангирова Н.А, Гамова Н.А., Раковская И.В. Применение ПЦР для выявления тетрациклиноустойчивых штаммов урогенитальных микоплазм // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. -1. - С. 43-46 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3