Способ определения 3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1Н-пурин-2,6-диона

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Хейдоров Василий Петрович Чалый Григорий Юрьевич Титорович Ольга Валерьевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56). , 1998. . 46. - . 6. - . 1357-1362.. . .,1989. - . 35. - . 2. - .298-301. ЗОЛКИНА И.В. Методики фармакокинетического моделирования препаратов пентоксифиллина, амброксола гидрохлорида и моксифлоксацина по количественному анализу их в слюне Автореф. дис. - М., 2009. ХЕЙДОРОВ В.П. Применение фенолгипохлоритной реакции для фотоэлектроколориметрического определения соединений группы пурина Автореф. дис. - М., 1971. - С. 5-16.7149 1, 2005.(57) Способ количественного определения 3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1 пурин-2,6-диона в лекарственных средствах, включающий обработку пробы химическими реагентами, фотометрирование полученного окрашенного раствора и определение содержания 3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1-пурин-2,6-диона, отличающийся тем, что к анализируемой пробе добавляют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты,затем полученный раствор последовательно обрабатывают гипохлоритом натрия при 23 С, а затем раствором фенола и 0,1 М раствором гидроксида натрия, полученный раствор нагревают до 50-60 С, а оптическую плотность полученного окрашенного раствора измеряют при длине волны 630 нм. Изобретение относится к аналитической химии органических соединений, а именно к способам определения 3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1 Н-пурин-2,6-диона, и может быть использовано в химико-фармацевтическом анализе для его количественного определения в лекарственных средствах. 3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1 Н-пурин-2,6-дион, или пентоксифиллин (ПФЛ),применяется в медицинской практике при нарушениях периферического кровообращения(эндартериит, болезнь Рейно и др.), цереброваскулярной патологии (атеросклеротические нарушения, ишемические состояния, после перенесенного инфаркта и др.), сосудистой патологии глаз, диабетической нефроангиопатии и других диабетических ангиопатиях,функциональных нарушениях слуха. 18704 1 2014.10.30 Для количественного определения ПФЛ в литературе описаны различные методы. По Европейской Фармакопее, так же как и по Британской ПФЛ (навеску 0,200 г одной пробы), растворяют в 5 мл безводной уксусной кислоты, добавляют 20 мл уксусного ангидрида. Титруют 0,1 М раствором хлорной кислоты, конец титрования определяют потенциометрически 1-2. Описанный метод применяется для определения ПФЛ в индивидуальном виде (субстанции), однокомпонентных лекарственных формах (таблетках, растворах, инъекционных растворах). Недостатками этого способа являются низкая избирательность и трудоемкость анализа, низкая чувствительность и, как следствие, большой расход исследуемого вещества на одно титрование (200 мг). Известны методы спектрофотометрического определения ПФЛ в лекарственных формах 3, 4. Они заключаются в растворении испытуемого образца в воде и разведении до определенной концентрации с последующим измерением оптической плотности полученного раствора при 274 нм относительно воды. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца ПФЛ. Недостатками этих методов являются низкая избирательность вследствие невозможности одновременного определения нескольких соединений без пробоподготовки или специальных приемов и возможность использования лишь для объектов с известным составом, где отсутствуют вещества с похожим или перекрывающимся УФ-спектром. Прототипом предложенного способа является фотометрический метод определения ПФЛ 5, который заключается в окислении ПФЛ избытком йода в присутствии щелочи с последующим определением непрореагировавшего йода и проведением контрольного опыта. Описываются два варианта определения оставшегося йода (варианты А и ). Определение йода по варианту А заключается в том, что 0,5-3,0 мл испытуемого раствора ПФЛ (200 мкг/мл) отмеривают в ряд градуированных пробирок на 25 мл. Затем добавляют 1,5-мл 0,089 -го водного раствора йода (0,0035 М 2 в 0,05 М ) и 1,0 мл 1 М раствора натрия гидроксида, общий объем доводят до 6,0 мл дистиллированной водой. Смесь термостатируют в течение 5 мин при 45-50 С для завершения реакции. Далее приливают 1,0 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, 15 мл буфера ( 3,0) и 2,0 мл 0,3 -го раствора метиламинофенола. Через 2 мин добавляют 1 мл 0,15 -го раствора изониазида. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при 620 нм спустя 5 и не позже 20 мин. Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Одновременно проводят контрольный опыт, который отличается от основного определения тем, что вместо 1,0 мл 1 М натрия гидроксида и 1,0 мл 1 М хлористоводородной кислоты приливают 2,0 мл дистиллированной воды, а именно такое же количество определяемого вещества приливают в ряд градуированных пробирок на 25 мл. Затем добавляют 1,5 мл 0,089 -го водного раствора йода (0,0035 М 2 в 0,05 М ) и 2,0 мл дистиллированной воды, общий объем доводят до 6,0 мл дистиллированной водой. Смесь термостатируют в течение 5 мин при 45-50 С для завершения реакции. Далее приливают 15 мл буфера( 3,0) и 2,0 мл 0,3 -го раствора метиламинофенола. Через 2 мин добавляют 1 мл 0,15 -го раствора изониазида. Различие в оптической плотности между контрольным и испытуемым растворами соответствует количеству йода, поглощенного лекарственным веществом. Расчет содержания ПФЛ проводят по калибровочному графику или по уравнению. Определение непрореагировавшего йода по варианту Б заключается в том, что в каждую градуированную пробирку на 25 мл, содержащую определенные количества исследуемого раствора ПФЛ (1,0-6,0 мл, 10 мкг/мл), приливают по 2,0 мл 1 М раствора натрия гидроксида, доводят водой до 10 мл. Содержимое термостатируют 5 мин при температуре 45-50 С и затем охлаждают до комнатной температуры, потом добавляют 3,0 мл раствора йода (200 мкг/мл) и разводят водой до 19 мл. Через 5 мин приливают 6,0 мл раствора кра 2 18704 1 2014.10.30 сителя шерстяного синего (200 мкг/мл) и измеряют оптическую плотность 5 мин спустя при длине волны 540 нм. Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Таким же образом готовят контрольный опыт (без исследуемого вещества) и раствор чистого красителя (без добавления исследуемого вещества и йода), оптическую плотность данных растворов измеряют против дистиллированной воды. Расчет содержания ПФЛ проводят по калибровочному графику или по уравнению. Данный способ-прототип 5 имеет ряд существенных недостатков 1. Применение йода в качестве реагента-окислителя содержит недостатки а) йод является летучим веществом и возможны его потери (испарение) при протекании реакции в течение 5 мин при 45-50 С, а затем при титровании оставшегося йода, поэтому йодометрическое титрование надо проводить быстро и по возможности на холоде б) йодид-ионы окисляются кислородом воздуха в) в щелочной среде йод диспропорционирует 2--13, происходит связывание свободного йода, т.е. потеря йода. По этой причине йодометрическое титрование нежелательно проводить в щелочной среде г) реакции с участием йода протекают медленно д) стандартные растворы йода и тиосульфата неустойчивы, при хранении их концентрацию необходимо проверять. 2. Недостаточная специфичность проводимой цветной реакции, т.к. применяемые реактивы имеют окраску. 3. Низкая чувствительность (680 и 16 мкг для варианта А и В соответственно). 4. Невысокая селективность (присутствие в пробе веществ с восстановительными свойствами приведет к ошибкам при определении). 5. Относительная трудоемкость применение шести химических реактивов и проведение контрольного опыта. 6. Короткое время устойчивости окрашенного соединения (до 20 мин), что будет затруднять проведение серийных анализов. Задачей изобретения является разработка новой цветной реакции и способа более простого, доступного и экономичного в расходовании анализируемого вещества, позволяющего повысить чувствительность, точность и селективность определения ПФЛ в индивидуальном виде и в лекарственных формах. Реализация поставленной задачи достигается за счет того, что определение ведут в пробирке, содержащей 30,0-300,0 мкг ПФЛ (3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1 Нпурин-2,6-диона), путем добавления к исследуемой пробе в пробирке 1 мл 1 -го раствора натрия гипохлорита и 1,0 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, затем через 5 мин прибавляют 1 мл 6 -го раствора фенола и 1,5 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида с последующим нагреванием реакционной смеси в пробирке и фотометрированием окрашенных растворов. Предложенный способ осуществляется следующим образом. Пример. Готовят раствор путем растворения 15 мг пентоксифиллина в очищенной воде в колбе на 50 мл. Отмеривают 0,6 мл приготовленного раствора пентоксифиллина (180 мкг), помещают в пробирку, добавляют 1,0 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, воды очищенной до 6,5 мл. Затем в пробирку быстро добавляют 1,0 мл 1 -го раствора гипохлорита натрия, перемешивают и термостатируют реакционную смесь при температуре 23 С. Через 5 мин в пробирку быстро приливают 1,0 мл 6 -го раствора фенола и 1,5 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и помещают в водяную баню (555 С) на 20 мин. Затем пробирку со смесью охлаждают и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при длине волны 630 нм (полученный окрашенный раствор устойчив при стандартных условиях в течение нескольких суток). Раствором сравнения служит смесь реактивов без определяемого веще 3 18704 1 2014.10.30 ства. По величине оптической плотности окрашенного раствора находят содержание ПФЛ в исследуемом растворе из градуировочного графика для ПФЛ или по формулест,ст где- содержание ПФЛ в анализируемой пробе, мкг- оптическая плотность анализируемой пробы ст - оптическая плотность стандартного раствора Сст - содержание ПФЛ (мкг) в пробе стандартного раствора. Стандартный раствор ПФЛ готовят путем растворения 15 мг ПФЛ в очищенной воде в мерной колбе на 50 мл. Определенные объемы стандартного раствора в пределах 0,1-1,4 мл переносят в пробирки, добавляют 1,0 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной,воды очищенной до 6,5 мл. Затем в пробирку быстро добавляют 1,0 мл 1 -го раствора гипохлорита натрия, перемешивают и термостатируют реакционную смесь при температуре 23 С. Через 5 мин в пробирку быстро приливают 1,0 мл 6 -го раствора фенола и 1,5 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и помещают в водяную баню (555 С) на 20 мин. Затем пробирку со смесью охлаждают и измеряют оптическую плотность полученного окрашенного раствора при длине волны 630 нм. Раствором сравнения служит смесь реактивов без определяемого вещества. Результаты анализа приведены в таблице. Метрологическая характеристика указывает на хорошую воспроизводимость и точность определения пентоксифиллина предлагаемым способом. Метрологические характеристики определения ПФЛ Взято ПФЛ,мкг/10 мл Примечание- средний результат определения 2 - дисперсия (сходимость)- стандартное отклонение (воспроизводимость)- стандартное отклонение среднего результата определения 0,95 - точность определения. 4 18704 1 2014.10.30 Положительный эффект предложенного способа состоит в том, что он 1) является простым, доступным и негромоздким в выполнении 2) не требует применения специальных реагентов 3) используемые реактивы бесцветны, их смеси без определяемого вещества - пентоксифиллина - (холостой опыт) не окрашены, поэтому не требуется проведения контрольного опыта 4) имеет высокую специфичность и чувствительность, открываемый минимум составляет 0,32 мкг/мл 5) имеет хорошую воспроизводимость и точность, полученные в результате реакции окрашенные растворы устойчивы, их окраска не изменяется в течении нескольких суток 6) имеет высокую экономичность в расходовании определяемого вещества подчинение основному закону светопоглощения наблюдается при очень малых концентрациях пентоксифиллина и в широком интервале в пределах 3,0-30,0 мкг в 1 мл конечного объема реакционного раствора (10 мл) 7) позволяет проводить серийные анализы. Способ может быть использован для определения пентоксифиллина в ампульных растворах и в таблетках, наполнители и стабилизаторы не мешают определению основного вещества. Предлагаемый способ основан на новой цветной реакции и может быть использован в заводских химических лабораториях, в контрольно-аналитических лабораториях фармацевтического профиля. 1., 2006. 2.. - 2001. -. . 3. ФС РБ 0519-09. Пентоксифиллин, раствор для инъекций 2 . 4. Аналитическая нормативная документация АНД Р.10.02/05407. Пентоксифиллин,таблетки. 5.,// . - 1998. - .46. - . 6. - . 1357-1362. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.