Способ диагностики ювенильного периодонтита

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЮВЕНИЛЬНОГО ПЕРИОДОНТИТА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Юдина Наталья Александровна Костюк Светлана Андреевна Люговская Анна Викторовна Глинкина Татьяна Владимировна Полуян Ольга Сергеевна Руденкова Татьяна Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ диагностики ювенильного периодонтита по выявлению, отличающийся тем, что выделяют из содержимого периодонтального кармана сорбционным методом ДНК микроорганизмов и проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров для детекции 53 и 5-3 иолигонуклеотидного меченого зонда 53 на этапе амплификации ДНК, причем проводят денатурацию ДНК при температуре 95 С в течение 1 минуты, отжиг в количестве 50 циклов сначала при температуре 95 С в течение 10 секунд, а затем при температуре 60 С в течение 30 секунд и элонгацию в количестве 50 циклов при температуре 72 С в течение 15 секунд, а концентрацию ДНКрассчитывают по формуле 10(-0,35711,723)/0,7,где- значение цикла амплификации ДНК при флуоресценции, превышающей пороговый уровень,и при получении значенияболее 105 копий на 1 мл содержимого периодонтального кармана диагностируют ювенильный периодонтит. Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может использоваться для диагностики ювенильного периодонтита с целью установления этиологического фактора заболевания. 14148 1 2011.04.30 Важную роль в этиопатогенезе ювенильного периодонтита играет. Методы клинической диагностики не позволяют выявить этиологически значимый возбудитель, что не дает объективную оценку патологическому процессу в тканях периодонта, снижает точность диагностики и эффективность терапии. Задачей изобретения является выявлениев содержимом периодонтального кармана, что поможет повысить точность диагностики, провести адекватные лечебные мероприятия и оценить эффективность проведенного лечения. Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ диагностики ювенильного периодонтита по выявлению, при котором выделяют из содержимого периодонтального кармана сорбционным методом ДНК микроорганизмов и проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров для детекции 53 и 53 иолигонуклеотидного меченого зонда 5-3 на этапе амплификации ДНК, причем проводят денатурацию ДНК при температуре 95 С в течение 1 минуты, отжиг в количестве 50 циклов сначала при температуре 95 С в течение 10 секунд, а затем при температуре 60 С в течение 30 секунд и элонгацию в количестве 50 циклов при температуре 72 С в течение 15 секунд, а концентрацию ДНКрассчитывают по формуле 10(-0,35711,723)/0,7,где- значение цикла амплификации ДНК при флуоресценции, превышающей пороговый уровень и при получении значенияболее 105 копий на 1 мл содержимого периодонтального кармана диагностируют ювенильный периодонтит. На фигуре представлена стандартная кривая, определяющая взаимосвязь концентрации ДНКи цикла , при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплифицированного продукта пересекаются. Пример 1. Пациент В., 15 лет. Жалобы на неприятный запах изо рта, кровоточивость десны во время чистки. Клинически десна бледно-розовая, при зондировании кровоточит, в области зубов 16, 26, 36, 46, 31, 32, 41, 42 периодонтальные карманы глубиной 6-7 мм. На ортопантомограмме вокруг зубов 16, 26, 36, 46 наблюдается билатеральная вертикальная резорбция на 1/2 длины корня зуба, горизонтальная деструкция на 1/3 длины корня в области резцов нижней челюсти. Для выявления у пациента В. ДНКв качестве биологического материала используют содержимое периодонтального кармана, так как здесь данный микроорганизм проявляет свою наибольшую активность. Забор биологического материала осуществляют из самого глубокого кармана в каждом из шести зубных секстантов. При этом наддесневую поверхность зуба очищают от налета, изолируют место забора материала стерильными ватными тампонами, просушивают. Стерильный бумажный штифт размером 35 вводят до дна кармана и оставляют в нем на 10 секунд, забранный материал погружают в герметично закрытый стерильный контейнер для транспортировки с транспортной средой. С выделенной сорбционным методом из биологического материала периодонтального кармана ДНКпроводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, при этом осуществляют амплификацию ДНКобщим объемом 100 мкл и ДНКстандартов, которые необходимы для определения концентрации ДНК при проведении ПЦР в режиме реального времени. Используемыми стандартами для определения концентрациислужат 10-кратно 2 14148 1 2011.04.30 разведенные серии геномаизвестных концентраций в диапазоне от 104 до 107 копий/мл. Проводят подготовку пробирок с ПЦР-смесью 1, содержащей смесь специфических праймеров, позволяющих детектировать специфический фрагмент ДНК, и нуклеотиды, раскапанные под воск. Размораживают пробирку с ПЦР-смесью 3, содержащуюолигонуклеотидный меченый зонд, который комплементарен специфическому фрагменту ДНК, и тщательно перемешивают содержимое. Праймеры для детекциии последовательностьолигонуклеотидного меченого зонда были выбраны из промоторного региона лейкотоксинового оперона (номер в 68133) с использованиемпрограммного обеспечения 53-(-праймер),53-(-праймер) определяют границы фрагмента промоторного региона лейкотоксинового оперона длиной 195 пар нуклеотидов(номер в 68133)олигонуклеотидный меченый зонд 53 метитсяв качестве флуорофора по 5 концу ипо 3 концу в качестве гасителя. Готовят ПЦР-смесь из расчета 7 мкл ПЦР-смеси 2 (буфер и полимераза) и 3 мкл ПЦРсмеси 3 на одну реакцию. В пробирки с ПЦР-смесъю 1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл приготовленной ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью 1. В подготовленные таким образом пробирки вносят ДНК по следующей схеме пробирка 1 - 5 мкл ДНК, выделенной из биологического материала пробирка 2 - 5 мкл стандарт 1(конц. 104 копий/мл) пробирка 3 - 5 мкл стандарт 1(конц. 104 копий/мл) пробирка 4 - 5 мкл стандарт 2(конц. 105 копий/мл) пробирка 5 - 5 мкл стандарт 2(конц. 105 копий/мл) пробирка 6 - 5 мкл стандарт 3(конц. 106 копий/мл) пробирка 7 - 5 мкл стандарт 3(конц. 106 копий/мл) пробирка 8 - 5 мкл стандарт 4(конц. 107 копий/мл пробирка 9 - 5 мкл стандарт 4(конц. 107 копий/мл) пробирка 10 - 5 мкл отрицательного контрольного образца. Помещают пробирки в ячейки ротора термоциклера 3000 (, Австралия). Задают следующую программу для амплификации ДНК 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали)95 С - 1 мин 2. Отжиг (присоединение праймеров)95 С - 10 с 60 С - 30 с 3. Элонгация (достраивание цепей ДНК)72 С - 15 с. Отжиг и элонгацию проводят в количестве 50 циклов. Этап амплификации при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиеммеченого олигонуклеотидного зонда основан на использовании 5-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют зонд, меченный на 5-конце флуоресцентным красителем, а на 3-конце фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Зонд комплементарен участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров меченый зонд количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во 3 14148 1 2011.04.30 время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять зонд за счет 5-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может детектироваться. Увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходной концентрацией матрицы, что дает возможность точно оценить концентрацию ДНК в биологическом материале. Для определения концентрацииДНКв биологическом материале периодонтального кармана строится стандартная кривая в следующих координатах- концентрация стандартов,- пороговый цикл(пороговый цикл значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплифицированного продукта пересекаются). Значенияпредсказываются, исходя из оценки входного уровнямеченого олигонуклеотидного зонда, то есть в стандартных условиях реакции, чем больше начальная концентрация образца, тем меньше(фигура). Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналудля него определяется значение порогового цикла, не превышающее 33. Отсутствие исследуемой ДНК ведет к отсутствию пересечения кривой флуоресценции порогового значения. Итоговое уравнение, характеризующие взаимосвязь порогового цикла флуоресценциии количества амплифицированной ДНК 10(-0,35711,723)/0,7 используется для расчета концентрации ДНКв 1 мл биологическом материале периодонтального кармана, где 0,7 - коэффициент , соответствующий эффективности выделения ДНКсорбционным методом,При определении концентрации ДНКпутем количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованиемолигонуклеотидного меченого зонда и смеси праймеров для проведения амплификации ДНКу данного пациента значение порогового цикла 18,55, поэтому 10(-0,35718,5511,723)/0,7180116 копий на 1 мл биологического материала периодонтального кармана. Диагностически значимой считается концентрацияДНКболее 105 копий на 1 мл биологического материала периодонтального кармана. Если полученная концентрация ДНКсоответствует диагностически значимой, то ставят диагноз ювенильный периодонтит. У пациента В обнаружена диагностически значимая концентрацияв биологическом материале периодонтального кармана, что позволяет поставить данному пациенту диагноз ювенильный периодонтит. Проведена профессиональная гигиена, антисептическая обработка полости рта, назначена соответствующая этиологическому фактору антибактериальная терапия. При повторном обследовании выявлена ДНКв концентрации 103 копий на 1 мл биологического материала периодонтального кармана,что отражает эффективность проведенного лечения. Таким образом, заявленный способ позволяет диагностировать ювенильный периодонтит, выбрать тактику лечения, а также оценить эффективность проведенной терапии за счет установления преимущественной роли патогенав развитии ювенильного периодонтита. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5