Способ диагностики респираторного хламидиоза

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕСПИРАТОРНОГО ХЛАМИДИОЗА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Костюк Светлана Андреевна Скороход Геннадий Алексеевич Силич Татьяна Владимировна Полуян Ольга Сергеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ диагностики респираторного хламидиоза, при котором проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с биологическим материалом из респираторного тракта больного, при этом используют праймеры 53 и 53 имеченый олигонуклеотид 5-3 спейсерного фрагмента гена 23 рРНК возбудителя семейства , а респираторный хламидиоз диагностируют при выявлении указанного олигонуклеотида в концентрации 102-104 копий в расчете на 1 мл биологического материала. Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ выявления возбудителей заболеваний различных отделов респираторного тракта хламидиальной природы, таких какиметодом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, при котором определяют вид возбудителя и его количественные характеристики. Данный способ является прототипом по отношению к заявляемому способу 1. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение возбудителей хламидиальной природы в биологическом материале пациентов путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с количественной схемой детекции продуктов амплификации. Однако известный способ обладает следующими недостатками при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени одновременно может определяться только один вид возбудителя семейства . Вследствие того что течение инфекционного процесса, индуцированного представителями семейства , схоже и протоколы лечения респираторных хламидиозов одинаковы, существующий способ выявления возбудителей в биологическом материале пациентов с 11062 1 2008.08.30 заболеваниями различных отделов респираторного тракта малоэффективен по причине длительности проведения данного вида исследования и, как следствие, несвоевременного назначения этиопатогенетической терапии. Задачей заявляемого способа является повышение вероятности выявления возбудителей респираторных хламидиозов в биологическом материале пациентов с заболеваниями различных отделов респираторного тракта за счет определения общего для нескольких видов возбудителей семействамолекулярного маркера. Поставленная задача осуществляется следующим образом. Предложен способ диагностики респираторного хламидиоза, при котором проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с биологическим материалом из респираторного тракта больного, при этом используют .1 53 и .2 53 имеченый олигонуклеотид 5-3 спейсерного фрагмента 23 рРНК возбудителя семейства ,респираторный хламидиоз диагностируют при выявлении указанного олигонуклеотида в концентрации 102-104 копий в расчете на 1 мл биологического материала. В качестве биологического материала возможно использование назофарингеальных соскобов эпителиальных клеток, материала из среднего носового хода (пазухи), забранного интраоперационно, а также мокроты. Пример 1. Необходимо выявить наличие или отсутствие возбудителей семействав мокроте пациента А с клиническим диагнозом двухсторонняя интерстициальная пневмония. Для выявления данных видов микроорганизмов применяют -специфичные праймеры иолигонуклеотидные пробы, выбранные из гена, кодирующего 23 рРНК. Они имеют следующие консервативные нуклеотидные последовательности .1 53 и .2 53, олигонуклеотидная меченая проба имеет нуклеотидную последовательность 5-АМ-3. Для проведения количественного анализа специфических фрагментов ДНК представителей семейства , т.е. для определения концентрации фрагмента гена 23 рРНК в биологическом материале, применяется полимеразная цепная реакция в режиме реального времени с использованием термоциклера 3000 ( ,Австралия) и программного обеспечения на базе компьютера-4. Для определения концентрации возбудителей в биологическом материале строится стандартная кривая в следующих координатах- концентрация стандартов,- пороговый цикл СТ (пороговый цикл - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплифицированного продукта пересекаются). Значения СТ предсказываются, исходя из оценки входного уровня пробы, то есть в стандартных условиях реакции, чем больше начальная концентрация образца, тем меньше СТ (фигура). Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналу АМ для него определяется значение порогового цикла, не превышающее 33. Отсутствие исследуемой ДНК ведет к отсутствию пересечения кривой флуоресценции порогового значения. Диагностически значимой считается концентрация фрагмента гена 23 рРНК семейства 102-104 копий в расчете на 1 мл биологического материала. Таким образом, если полученная концентрация фрагмента гена соответствует диагностически значимой, то можно утверждать о преимущественной роли этих видов микроорганизмов в развитии данной патологии. Определение концентрации фрагмента гена 23 рРНК семействав исследуемом биологическом материале проводится по следующей формуле 11062 1 2008.08.3010(-0,33322,0312,843)92047 копий в расчете на 1 мл биологического материала,где- концентрация фрагмента гена 23 рРНК,22,03 - значение порогового цикла СТ. Полученное значение концентрации позволяет судить о присутствии в респираторном тракте пациента А возбудителей семейства . Пример 2. Необходимо выявить наличие или отсутствие возбудителей семействав назофарингеальном соскобе эпителиальных клеток пациента В с клиническим диагнозом хронический синусит. Аналогичным образом для выявления данных видов микроорганизмов применяют-специфичные праймеры иолигонуклеотидные пробы, выбранные из гена, кодирующего 23 рРНК. Для определения концентрации возбудителей в биологическом материале строится стандартная кривая согласно примеру 1. Определение концентрации фрагмента гена 23 рРНК семействав биологическом материале проводится по следующей формуле 10(-0,33339,4812,843)0,48 копий в расчете на 1 мл биологического материала,где- концентрация фрагмента гена 23 рРНК,39,48 - значение порогового цикла СТ. Полученное значение концентрации позволяет судить об отсутствии в респираторном тракте пациента В возбудителей семейства . Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующее преимущество использование -специфичных праймеров способствует повышению частоты выявления возбудителей респираторных хламидиозов в биологическом материале пациентов с заболеваниями различных отделов респираторного тракта за счет определения молекулярного маркера возбудителей семейства , что, в свою очередь, сокращает время проведения исследования и дает возможность своевременного назначения этиопатогенетической терапии. Источники информации 1..,,,,.,. - //. - 2005. - .52. - . 7-14. - прототип. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3