Способ определения остаточного количества тетрациклинов в продуктах питания с большим содержанием жира

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНОГО КОЛИЧЕСТВА ТЕТРАЦИКЛИНОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ С БОЛЬШИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЖИРА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Масалов Игорь Николаевич Шупилова Екатерина Павловна Шуляковская Ольга Васильевна Застенская Ирина Алексеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56) Временная методика. Определение содержания тетрациклинов в продукции животноводства методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрофотометрическим детектором. - Минск, 2010... . . . 2010. - . 1217. - . 41. - . 6394-6404... . . . 2009. - . 877. - . 23. - . 2263-2374. Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства.3049-84. Методические указания МУК 4.2.02695. Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах.(57) Способ определения остаточного количества тетрациклинов в продуктах питания с большим содержанием жира, при котором к анализируемой пробе добавляют демеклоциклин в качестве внутреннего стандарта, экстрагируют антибиотики тетрациклиновой группы экстракционным буфером с двухкратной очисткой гексаном, повторно экстрагируют экстракционным буфером, объединенные экстракты фильтруют через бумажный фильтр синяя лента и шприцевой фильтр-45/25 , очищают методом ТФЭ на картриджеОРТ, упаривают в токе воздуха при температуре 40 С, полученный экстракт разбавляют раствором водаметанолмуравьиная кислота, взятые в объемном соотношении 90100,5, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин, фильтруют и полученный фильтрат анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе -1200 с масс-спектрометрическим детектором-6410, оснащенном металлической колонкой длиной 150 мм, диаметром 2,1 мм,заполненной неподвижной фазой 18 с зернением 3,5 мкм, и аналогичной предколонкой, в качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и 0,1 -ного водного раствора муравьиной кислоты, взятых в соотношении 1585 в момент начала анализа,с градиентом по времени, причем скорость подвижной фазы составляет 0,3 см 3/мин, и рассчитывают содержание каждого из компонентов методом внутреннего стандарта. 17825 1 2013.12.30 Изобретение относится к медицине, к разделу аналитической химии медицинских препаратов, и может использоваться для контроля за остаточным содержанием тетрациклинов в продукции животноводства и продуктах питания. Известен способ определения остаточного количества тетрациклинов в продукции животноводства методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектором 1. По данной методике определение тетрациклинов проводят следующим образом 100 г анализируемой пробы предварительно подготавливают и измельчают на гомогенизаторе, из полученной средней пробы взвешивают 1 г образца и помещают его в полипропиленовую пробирку. После этого добавляют внутренний стандарт и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см 3 экстракционного буфера и помещают на 1 мин на вортекс, после чего оставляют для уравновешивания на 15 мин в горизонтальном положении. Затем центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин при температуре 4 С. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые полипропиленовые пробирки. После чего полученные экстракты подвергают процедуре твердофазной экстракции (ТФЭ) на картриджеОРТ. Перед нанесением экстракта на картридж последовательно кондиционируют сорбент 2 см 3 метанола и 2 см 3 воды, наносят анализируемый экстракт,промывают картридж 2 см 3 деионизованной воды и сушат в вакууме водоструйного насоса в течение 5 мин. После этого элюируют тетрациклины 6 см 3 метанола с 0,5 об.муравьиной кислоты. Элюат помещают на нагревательный модуль и упаривают в токе воздуха при температуре 40 С до 0,5 см 3. Полученный экстракт доводят до 1 см 3 раствором водаметанолмуравьиная кислота в соотношении 90100,5 соответственно, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин, фильтруют через шприцевой фильтр в виалу для автосэмплера и полученный раствор анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ/МС/МС). Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются экстракция тетрациклинов экстракционным буфером, очистка экстракта методом ТФЭ, упаривание органического растворителя и последующее определение тетрациклинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Однако способпрототип не позволяет с достаточной степенью достоверности проводить анализ проб, содержащих большое количество жира (масло, жир), вследствие недостаточного диспергирования указанных проб в экстракционном буфере, что может приводить к получению заниженных результатов. Задачей заявляемого способа является повышение точности определения тетрациклинов в указанных пробах за счет введения в пробоподготовку дополнительной стадии экстракции жира гексаном, в котором анализируемые соединения будут нерастворимы. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения остаточного количества тетрациклинов в продуктах питания с большим содержанием жира, при котором к анализируемой пробе добавляют демеклоциклин в качестве внутреннего стандарта, экстрагируют антибиотики тетрациклиновой группы экстракционным буфером с двухкратной очисткой гексаном, экстракт фильтруют через бумажный фильтр синяя лента и шприцевой фильтр 45/25 , очищают методом ТФЭ на картриджеОРТ, упаривают в токе воздуха при температуре 40 С, полученный экстракт разбавляют раствором водаметанолмуравьиная кислота, взятые в объемном соотношении 90100,5, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин, фильтруют и полученный фильтрат анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе -1200 с масс-спектрометрическим детектором -6410, оснащенном металлической колонкой длиной 150 мм,диаметром 2,1 мм, заполненной неподвижной фазой 18 с зернением 3,5 мкм,и аналогичной предколонкой, в качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила и 0,1 -ного водного раствора муравьиной кислоты, взятых в соотношении 1585в мо 2 17825 1 2013.12.30 мент начала анализа, с градиентом по времени, причем скорость подвижной фазы составляет 0,3 см 3/мин, и рассчитывают содержание каждого из компонентов методом внутреннего стандарта. Пример. Для определения содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в образце масла 100 г анализируемой пробы предварительно подготавливают, из полученной средней пробы взвешивают 1 г в полипропиленовую пробирку объемом 50 см 3. К пробе добавляют 100 мм 3 внутреннего стандарта (демеклоциклин) концентрацией 100 нг/см 3 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см 3 экстракционного буфера и помещают на 1 мин на вортекс, после чего оставляют для уравновешивания на 15 мин в горизонтальном положении. После этого к полученной смеси добавляют 15 см 3 гексана,встряхивают на вортексе в течение 10 мин и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин при температуре 4 С, после чего верхний органический слой отбирают пипеткой,процедуру очистки гексаном повторяют еще один раз. Затем экстракт фильтруют через бумажный фильтр синяя лента и шприцевой фильтр-45/25 в чистые полипропиленовые пробирки. После чего экстракт подвергают процедуре ТФЭ на картриджеОРТ. Перед нанесением экстракта на картридж последовательно кондиционируют сорбент 2 см 3 метанола и 2 см 3 деионизованной воды, наносят анализируемый экстракт, промывают картридж 2 см 3 деионизованной воды и сушат под вакуумом в течение 10 мин. После этого элюируют тетрациклины 6 см 3 метанола с 0,5 об.муравьиной кислоты. Элюат помещают на нагревательный модуль и упаривают в токе воздуха при температуре 40 С до 0,5 см 3. Объем полученного экстракта доводят до 1 см 3 раствором водаметанолмуравьиная кислота в соотношении 90100,5 соответственно, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин, фильтруют через шприцевой фильтр-20/15 в виалу для автосэмплера, затем компоненты полученного экстракта разделяют и регистрируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на жидкостном хроматографе -1200 с масс-спектрометрическим детектором -6410 с металлической колонкой длиной 150 мм, диаметром 2,1 мм, заполненной неподвижной фазой 18 с зернением 3,5 мкм и аналогичной предколонкой, при этом измерения на масс-спектрометрическом детекторе производят в режиме мониторинга множественных реакций (МКМ), определяемые ионы и основные настройки детектора при определении содержания остаточного количества антибиотиков тетрациклиновой группы в анализируемой пробе приведены в табл. 1. Таблица 1 Определяемые ионы и основные настройки детектора при определении содержания остаточного количества антибиотиков тетрациклиновой группы Вещество Окситетрациклин Тетрациклин Демеклоциклин (внутренний стандарт) Хлортетрациклин Доксициклин 17825 1 2013.12.30 В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил - 0,1 -ный водный раствор муравьиной кислоты в соотношении 1585, соответственно в начальный момент анализа с градиентом, указанным в табл. 2. Таблица 2 Градиент мобильной фазы Время Содержание 0,1 -ного водного раствора муравьиной кислоты 85 70 40 20 0 Подвижная фаза имеет скорость 0,3 см 3/мин, а количественное определение каждого компонента осуществляют методом внутреннего стандарта по соотношению площадей пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта. Линейный диапазон детектирования 0,5-50 нг. Нижний предел измерения концентрации каждого из тетрациклинов составляет 0,3 мкг/кг. Степень извлечения не менее 80 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что предложенный способ позволяет быстро с высокой чувствительностью, селективностью и точностью определять содержание тетрациклинов в продуктах питания с большим содержанием жира. Источники информации 1. Временная методика. Определение содержания тетрациклинов в продукции животноводства методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Утв. 05.07.2010 Гл. гос. сан. врачом МЗ РБ. - С. 1-16 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4