Способ подготовки аутологичных моноцитарных дендритных клеток для иммунотерапии туберкулеза

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОДГОТОВКИ АУТОЛОГИЧНЫХ МОНОЦИТАРНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Титов Леонид Петрович Гончаров Андрей Евгеньевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Способ подготовки аутологичных моноцитарных дендритных клеток для иммунотерапии туберкулеза, заключающийся в том, что выделяют в стерильных условиях из периферической крови больного туберкулезом моноциты, культивируют их до получения незрелых моноцитарных дендритных клеток, также выделяют микобактерии от того же больного, лизируют микобактерии 15-25-кратным замораживанием в жидком азоте с последующим оттаиванием, фильтруют полученный лизат, содержащий антигены микобактерий,15969 1 2012.06.30 через фильтр с порами 0,1-0,2 мкм, после чего праймируют незрелые моноцитарные дендритные клетки антигенами лизата, индуцируют созревание указанных клеток до экспрессии 11 не менее 90 , 86 - не менее 80 и 83 - не менее 80 и осуществляют контроль стерильности полученных зрелых моноцитарных дендритных клеток. Изобретение относится к области медицины, в частности к методам клеточной биотехнологии, и может быть использовано с целью специфической иммунотерапии дендритными клетками (ДК) больных туберкулезом. Для терапии больных хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями используют ДК, полученные из моноцитов 1, 2. Праймирование зрелых ДК соответствующими антигенами позволяет получить антигенспецифические ДК. Имеются опубликованные результаты клинических испытаний, показывающие возможность иммунотерапии больных хроническим гепатитоми ВИЧ-инфекцией 3, 4. Способ лечения туберкулеза с использованием аутологичных антигенспецифических моноцитарных ДК до настоящего времени не описан. Задачей исследования явилась разработка оптимального способа подготовки культур аутологичных антигенспецифических моноцитарных ДК для иммунотерапии туберкулеза. Задача решается способом подготовки аутологичных моноцитарных ДК для иммунотерапии туберкулеза, заключающемся в том, что выделяют в стерильных условиях из периферической крови больного туберкулезом моноциты, культивируют их до получения незрелых моноцитарных дендритных клеток, также получают культуру микобактерий от того же больного, размножают их культивированием, лизируют микобактерии 15-25-кратным замораживанием в жидком азоте с последующим оттаиванием, фильтруют полученный лизат, содержащий антигены микобактерий, через фильтр с порами 0,1-0,2 мкм, после чего праймируют незрелые моноцитарные дендритные клетки антигенами лизата, индуцируют созревание указанных клеток до экспрессии 11 с не менее 90 , 86 - не менее 80 и 83 - не менее 80 и осуществляют контроль стерильности полученных зрелых моноцитарных дендритных клеток. Способ осуществляют следующим образом 1) получают специфический антиген путем 15-25-кратного лизиса микобактерий, выделенных от больного туберкулезом, после чего фильтруют лизат через 0,1-0,2 мкм фильтры для удаления жизнеспособных бактериальных клеток 2) из периферической крови выделяют моноциты, которые культивируют на бессывороточной среде - (или аналогичной), содержащей рекомбинантные человеческие цитокины - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (ИЛ-4) для индукции дифференцировки моноцитов в ДК 3) ДК больного туберкулезом праймируют 10 мкг/мл лизата аутологичных микобактерий на протяжении 6 часов 4) в качестве индуктора созревания моноцитарных ДК используют комбинацию рекомбинантного человеческого фактора некроза опухолей- (ФНО-) и 6,2-О-дибутириладенозин 3,5-цАМФ (дибутирил цАМФ) 5 или аналогичный 5) проводят контроль зрелости ДК путем определения их иммунофенотипа (относительное число ДК в культуре, экспрессирующих молекулу 11 с, не должно быть менее 90 , 86 - менее 80 ,83 - менее 50 ) 6) проводят контроль на наличие контаминации бактериями и дрожжеподобными грибами. Схема подготовки культур ДК представлена на фигуре. Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером. 2 15969 1 2012.06.30 Пример. Влияние ДК, праймированных лизатом аутологичных микобактерий, на пролиферацию аутологичных Т-лимфоцитов и продукцию ими внутриклеточных цитокинов ИЛ-4 и интерферона- (ИНФ-). 1. Получение культур незрелых ДК. Эксперименты проводили на незрелых моноцитарных ДК, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластиковых культуральных планшетах. Из крови доноров (контрольная группа,7) и больных множественноустойчивым туберкулезом (5) центрифугированием на градиенте плотности фиколлпака выделяли фракцию мононуклеаров периферической крови (МПК), затем из полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике. Для получения незрелых ДК моноциты культивировали 7 суток в питательной среде -,содержащей рекомбинантные человеческие цитокины (50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4). 2. Получение лизата микобактерий. Культуры микобактерий выращивали на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена. Для получения лизата культуры микобактерий отмывали дважды в фосфатно-солевом растворе, затем суспендировали в 1 мл воды и помещали в пробирку. Микобактерии лизировали 20-кратным замораживанием в жидком азоте с последующим оттаиванием, после чего фильтровали содержимое пробирки через фильтры с порами 0,2 мкм. Концентрацию белка определяли методом Бредфорда. 3. Праймирование и индукция созревания ДК. ДК культивировали на протяжении 6 часов в питательной среде с 10 мкг/мл лизата аутологичных микобактерий. Затем ДК отмывали от лизата микобактерий и культивировали в питательной среде, содержащей 25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4, а также ФНО- (50 нг/мл) и дибутирил цАМФ(500 мкг/мл) в качестве индуктора созревания. Клетки культивировали при 37 С в увлажненной атмосфере с 52 в течение 18 часов. 4. Оценка антигенпредставляющей функции ДК. Для оценки антигенпредставляющей функции ДК на продукцию 41 и 42 цитокинов аутологичными Т-лимфоцитами аутологичные лимфоциты культивировали со зрелыми ДК в соотношении 201 в 1 мл питательной среды на протяжении 72 часов. Затем питательную среду меняли на новую, содержащую форбол-12-миристат-13-ацетат 25 нг/мл и иономицин 1 мкг/мл и культивировали 48 часов. В последние 6 часов культивирования добавляли в среду бромодезоксиуридин (БРДУ) в концентрации 10 мкМ и монензин (10 мкг/мл) в качестве ионофора. Для детекции внутриклеточных цитокинов и БРДУ клетки фиксировали в 4 растворе параформальдегида, затем пермеабилизировали в 0,1 растворе сапонина. При определении БРДУ суспензию клеток дополнительно инкубировали с 100 мкл ДНК-азы(200 мкг/мл) 60 минут при 37 С. Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к внутриклеточным цитокинам и БРДУ и с соответствующими изотипическими контролями 15 минут при 4 С. После истечения времени инкубации проводили учет результатов на проточном цитофлюориметре . 5. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения 8. Значения показателей представлены в виде(25-75), где- медиана, а 25 и 75 - интерквартильный размах в виде 25-й и 75-й процентилей. Для сравнения выборок использовали непараметрические критерии. В качестве критерия достоверности различий показателей принимали уровень значимости 0,05. Результаты. В результате исследований показан эффект ДК на пролиферацию аутологичных Т-лимфоцитов. Так, число пролиферирующих Т-лимфоцитов в культуре МПК,культивированных в присутствии ДК, было достоверно больше по сравнению с МПК,культивированных без ДК (табл. 1). Относительное число Т-лимфоцитов, содержащих внутриклеточно ИЛ-4, достоверно не отличалось в культурах МПК и МПКДК. В то же время выявлены достоверные отличия во внутриклеточной продукции ИНФ- Т-лимфоцитами в культурах МПК и МПКДК (0,028), что указывает на наличие 1-поляризующего эффекта мДК на аутологичные Т-лимфоциты больных туберкулезом. 3 15969 1 2012.06.30 Таблица 1 Экспрессии поверхностных молекул ДК больных туберкулезом Молекула Относительное число клеток,1 82,0 (68,1-85,8) 11 с 97,1 (94,6-97,6) 40 99,7 (99,4-99,9) 54 92,0 (91,6-93,3) 83 90,6 (89,4-90,9) 86 97,3 (92,8-98,0) 95,5 (93,9-97,0) Фенотип зрелых ДК. Более 97 клеток в культурах ДК больных туберкулезом и доноров, экспрессировали молекулу 11 с, что подтверждает их миелоидное происхождение (табл. 2). Таблица 2 Полиферация и содержание внутриклеточных цитокинов лимфоцитов после сокультивирования с аутологичными ДК Относительное число клеток,Исследуемый показатель МПК МПКДК (201) Внутриклеточный ИЛ-4 1,4 (1,2-1,8) 1,4 (1,2-2,3) 0,754 13,9 (12,6-16,9) 22,8 (21,3-24,9) 0,028 Внутриклеточный ИФНПролиферация 2,1 (1,3-3,4) 10,1 (9,4-12,4) 0,04 В целом, ДК больных туберкулезом, активированные при помощи комбинации ФНОи дибутирил-цАМФ, адекватно экспрессировали молекулы активации (83), костимуляции (40, 86), межклеточной адгезии (11 с, 54), молекулу главного комплекса гистосовместимости (ГКС) - - и ГКС-подобную молекулу 1 а. Микробиологический контроль. Посев культур ДК на тиогликолевую среду и среду Сабуро показал отсутствие контаминации исследованных клеток бактериями и дрожжеподобными грибами. Таким образом, показана возможность использования лизата аутологичных микобактерий для праймирования ДК больных туберкулезом. Источники информации 1..,.,,,.,.,., .// . . . . 2008. - . 65. - . 3. - . 191-199. 2.,,.,.,.,.,// . . . - 2004. - . 114. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4